6.2.3 Cowpea Mosaic Virus

Cowpea mosaic virus (CPMV; Comovirus, Comoviridae) je nejrozsáhleji studovanou platformou pro různé konjugace a biotechnologické aplikace. Je to 30 nm ikosaedrický virus a skládá se z bipartitního pozitivně smysluplného, jednořetězcového genomu RNA, přičemž každá molekula RNA je zapouzdřena v samostatné částici. Kapsida CPMV se skládá z 60 kopií dvou různých CP podjednotek (označovaných jako malá, 24 kDa, a velká, 42 kDa) s pseudo T = 3 ikosaedrickou symetrií. Vzhledem k přítomnosti vysoce symetrické a heteromerní povahy kapsidy poskytuje CPMV pozoruhodnou příležitost diferencovaně zavádět (v pětinásobné nebo trojnásobné či obou polohách) více typů funkcí pomocí specifického genetického a chemického inženýrství s kontrolou nad prostorovou distribucí i stupněm multivalence (Uchida et al., 2007; Young et al., 2008; Steinmetz, 2010; Wen et al., 2016). CPMV lze purifikovat ve velkém množství z infikovaných listů a je stabilní v širokém rozmezí teplot (až 60 °C) a v rozmezí pH 3,0-9,0 a odolává některým organickým rozpouštědlům (Steinmetz et al., 2009). Kapsidy CPMV se používají k řízené imobilizaci aktivních enzymů. Využití kapsid CPMV pro šablonovitou výrobu kovových nanočástic pomocí elektrolytické depozice (ELD) a mineralizace různými procesy umožnilo výrobu tenkých vrstev kovů a slitin s jednotnou tloušťkou a složením. CPMV viriony se používají jako nanostavební bloky pro řízenou konstrukci 2-D a 3-D struktur pomocí přístupu zdola nahoru, vrstva po vrstvě (LbL) pro potenciální aplikace jako nanoelektronická zařízení nebo elektrochemické vícenásobné biosenzory (přehled v Culver et al., 2015; Wen et al., 2015a, 2016; Narayanan a Han, 2017a).

Nativní částice CPMV a CPMV derivatizované lanthanoidovými komplexy kovů byly na základě studií biodistribuce, toxicity a patologie těchto částic in vivo shledány bezpečnými a netoxickými (Rae et al., 2005; Singh et al., 2007). Bylo zjištěno, že CPMV je spojen s oblastmi zánětu a vyvolává narušení hematoencefalické bariéry během infekce centrálního nervového systému (CNS) u myší (Shriver et al., 2009). CPMV s povrchovou PEGylací vykazoval nízkou imunogenicitu a internalizaci bylo zabráněno v několika typech buněk v důsledku snížení nespecifické vazby (Raja et al., 2003). Manchester a spolupracovníci zjistili, že fluorescenčně značený CPMV má endogenní schopnost být vychytáván cévními endotelovými buňkami a může být použit jako intravitální zobrazovací sonda k vizualizaci cévního řečiště a krevního toku do hloubky až 500 μm po dobu 72 h u živých embryí myší a kuřat (Lewis et al., 2006). Bylo zjištěno, že CPMV má přirozenou schopnost vázat se na povrchový vimentin, cytoskeletální protein, který moduluje architekturu a dynamiku buněk, a bylo zjištěno, že je nadměrně exprimován v endoteliálních, nádorových a zánětlivých buňkách (Koudelka et al., 2009). Biokompatibilní, přirozená interakce s vimentinem a retenční vlastnosti endotelu CPMV byly dále využity k zobrazení nádorové angiogeneze a navádění nádorů in vivo (Leong et al., 2010; Steinmetz et al., 2011; Yildiz et al., 2011; Wen et al., 2015a).

Vnější povrch kapsidy CPMV byl rozsáhle modifikován pomocí přirozeně se vyskytujících nebo geneticky upravených exponovaných zbytků lysinu, cysteinu, tyrozinu a kyseliny asparagové a glutamové za použití standardních chemických konjugačních metod a konjugačních příčných pojiv k připojení několika činidel, jako jsou nanočástice Au, redoxně reaktivní methylviologenové části, organokovové ferrocenové karboxylátové části, fluorofory, biotin, PEG řetězce, stilbenové deriváty, sacharidy, heterologní proteiny (např.g., lidský holo-transferrin, T4 lysozym, LRR domian internalinu B a produkt genu Intron 8 tyrosinkinázového receptoru HER2), protilátky, oligonukleotidy, polovodičové kvantové tečky a fullereny. Inkorporace nepřirozených aminokyselin do kapsidy CPMV byla provedena pomocí několika ortogonálních chemií (jako je chemoselektivní hydrazonová ligační strategie a mědí katalyzovaná azido-alkynová cykloadice (CuAAC) nebo „click“ reakce). Tyto snahy usnadnily využití částic CPMV jako optických sond, kandidátů na vakcíny a paměťových a senzorových nanozařízení (přehled v Young a kol., 2008; Destito a kol., 2009; Grasso a Santi, 2010; Steinmetz, 2010; Lomonossoff a Evans, 2011; Wen a kol., 2015a; Zhang a kol., 2016; Lee a kol., 2016b; Narayanan a Han, 2017a). CPMV a TMV byly naloženy tak, aby nesly kontrastní látky pro duální modalitu magnetické rezonance (MR) a optického zobrazování, a obě modality prokázaly specifitu vazby fibrinu in vitro s přítomností cílových peptidů. Preklinické studie na modelu trombózy při fotochemickém poranění karotické tepny potvrdily navádění nanosond na tromby, přičemž podlouhlé tyčinky TMV vykazovaly významně větší vazbu na tromby než ikosaedrické CPMV (Wen et al., 2015b,c). CPMV zdobené peptidy E7p72 (vysoce afinitní peptid vázající doménu podobnou epidermálnímu růstovému faktoru 7 (EGFL7), který se specificky zaměřuje na lidské endoteliální buňky) se zaměřily na neovaskulaturu spojenou s nádorem s vysokou specificitou, jak bylo posouzeno pomocí intravitálního zobrazování (Cho et al., 2017).

Protokoly sestavování kapsidových podjednotek CPMV in vitro a in vivo nejsou dosud dobře zavedeny. To omezuje jeho potenciál pro použití jako nanokontejneru pro enkapsulaci molekul nákladu. Nativní obsah nukleové kyseliny ve virionech CPMV byl použit jako elektrostatická houba k přitahování zobrazovacích látek a terapeutických molekul pomocí jednoduché infuzní techniky (Yildiz et al., 2013). Tranzientní koexprese prekurzoru CPMV (VP60), který se skládá ze sloučených velkých a malých proteinů, a proteinázy 24K pro proteolytické zpracování VP60 v rostlinách vedla ke vzniku CPMV VLP (eCPMV), které byly zcela zbaveny RNA (viru nebo hostitele) (Saunders et al., 2009). Takové prázdné kapsidy byly použity k přenosu široké škály nákladových molekul, jako jsou kovy, fluorescenční barviva nebo léčiva (Culver et al., 2015; Wen et al., 2015a; Narayanan a Han, 2017a). Fluorofory, biotinové afinitní značky, PEG a různé peptidy byly selektivně zobrazeny na vnitřním povrchu prázdného CPMV zacílením na reaktivní lyziny (Wen a kol., 2012b). Účinnost eCPMV jako vakcíny in situ byla prokázána na myších modelech metastazujícího melanomu, rakoviny prsu, rakoviny vaječníků a rakoviny tlustého střeva, kde vyvolala protinádorovou imunitní odpověď spuštěním aktivace a infiltrace neutrofilů, což vedlo k chemo/cytokinovému profilu, který vede k aktivaci adaptivní imunity. Většina myší, kterým byl rechallengován nádor na opačném boku, rechallengovaný nádor zcela odmítla (Lizotte et al., 2016). Intratumorální podání magnetických nanočástic (mNP) k navození hypertermie a eCPMV v kombinaci zlepšilo lokální i systémovou účinnost léčby nádoru (zpomalení sekundárního růstu nádoru (abskopální efekt) a odolnost vůči rechallenge nádoru) u buněčných modelů nádoru mléčné žlázy u myší C3H/MTG-B a myší C57-B6/B-16-F10 (Hoopes et al., 2017a). Za použití osmi spontánních psích karcinomů (dva orální melanomy, tři orální amelioblastomy a jeden karcinom) Hoopes et al (2017b) prokázali, že kombinace hypofrakcionovaného záření a hypertermie vyvolané mNP a intratumorální léčby eCPMV vyvolává zvýšenou imunitní odpověď.

Pro využití CPMV k cílenému doručování léčiv do nádorových buněk a k překonání přirozené interakce mezi CPMV a savčími buňkami byla použita „click“ reakce ke konjugaci PEG a folátového ligandu (CPMV-PEG-FA) s CPMV. Tato konjugace umožnila specifické zacílení CPMV na folátové receptory (FR) exprimující buňky HeLa a KB (Destito et al., 2007). Cílení CPMV na nádorové buňky neuroblastomu bylo dosaženo genetickou modifikací CPMV tak, aby zobrazoval analog neuropeptidu Y (NPY) jako cílový ligand. Bylo prokázáno, že CPMV-NPY interagoval specificky s buňkami SK-N-MC, které nadměrně exprimovaly receptor Y1 (Destito et al., 2009; Ma et al., 2012). Zobrazení zaměřeného na receptory bylo dosaženo ukotvením krátkých peptidových sekvencí (F56 a bombesin specifických pro receptor pro vaskulární endoteliální růstový faktor-1 (VEGFR-1)), resp. receptory pro peptid uvolňující gastrin (GRPR) k CPMV. Bylo zjištěno, že tyto senzory na bázi CPMV jsou specifické při vazbě na nádorové buňky, které tyto receptory na povrchu buněk nadměrně exprimují (Brunel et al., 2010; Steinmetz et al., 2011). Wen a Steinmetz (2014) vyvinuli přístup zdola nahoru pro syntézu nanočástic CPMV, dimerů a sestav obsahujících cílové ligandy (cyklické peptidy RGD) a fluorescenční barviva a zjistili, že symetrická prezentace peptidů RGD a dimerizace nanočástic zvyšuje účinnost cílení na rakovinné buňky.

CPMV byl úspěšně použit pro zobrazení několika heterologních peptidů k vyvolání imunitní odpovědi. Imunizace zvířat každou z chimér vyvolala silnou humorální imunitní odpověď, která byla protektivní proti napadení příslušným patogenem. Multivalentní zobrazení antivirových molekul a sacharidů na CPMV usnadnilo jejich využití pro terapeutické aplikace (Lomonossoff a Evans, 2011; Koudelka a kol., 2015; Hefferon, 2017). Aljabali et al. (2013) zavedli kovalentní konjugaci doxu s CPMV prostřednictvím amidové vazby nebo disulfidového můstku s využitím lysinových nebo cysteinových zbytků na vnějším povrchu CPMV. CPMV navázané na dox vykazovaly vyšší účinek zabíjení buněk než volný dox, a to i při nízkých dávkách. CPMV modifikovaný korunkou ze záporně nabitých dendronů byl použit k nabití kladně nabitých fotosenzitizérů (pro fotodynamickou terapii (PDT)). Tento hybridní nosičový systém PDT-CPMV byl účinný při zabíjení melanomových buněk i makrofágů in vitro (Wen et al., 2016). Překonání dávku omezující nespecifické toxicity trojmocného chromu (prospěšné minerální živiny), který může selektivně inhibovat proliferaci lidských buněk hladkého svalstva aorty (HASMC) indukovanou vysokým obsahem glukózy in vitro, chlorid chromitý byl infuzí vložen do vnitřní dutiny CPMV a výsledné částice CPMV naložené CrCl3 (CPMV-Cr) významně snížily glukózou indukovanou proliferaci HASMC a vykazovaly antiaterogenní účinky za hyperglykemických podmínek (Ganguly et al., 2016).