STRUKTURÁLNÍ ZÁKLADY MECHANISMU ÚČINKU

Mezi podjednotkami rRNA je dobře prozkoumána 16S rRNA z Escherichia coli a zejména byly zkoumány interakce různých aminoglykosidových antibiotik s 16S rRNA a jejich účinky na proces translace mRNA na polypeptid. Podobné struktury rRNA existují i u jiných organismů, jako jsou kvasinky a Tetrahymena (33). Ošetření rRNA aminoglykosidem chrání některé nukleové báze v rRNA před chemickou modifikací, což znamená, že tyto molekuly mají vysokou afinitu k určitým místům v rRNA. Tento způsob vazby přirovnal Noller (35) k inhibitorům enzymů, které se obvykle vážou na aktivní místa enzymů a narušují jejich činnost. Různé třídy aminoglykosidových antibiotik se vážou na různá místa na rRNA v závislosti na jejich strukturní komplementaritě. Předpokládá se například, že neomycin, paromomycin (obr. 1), gentamicin a kanamycin se vážou na místo A na 16S rRNA v E. coli podobným způsobem a v experimentech s chemickými stopami bylo prokázáno, že chrání báze A1408 a G1494 (obr. 2) (33). Čtyři báze, A1408, A1492, A1493 a G1494, v místě A rRNA interagují s tRNA, i když s různou afinitou. Vazba výše uvedených aminoglykosidů na místo A v dekódovací oblasti (tj. v místě rozpoznávání kodonu a antikodonu) narušuje přesné rozpoznávání kognitivní tRNA rRNA během translace (35). Předpokládá se, že tyto interakce také narušují translokaci tRNA z místa A do místa peptidyl-tRNA (místo P).

Puglisi a spolupracovníci (12-14, 39) nedávno poskytli strukturní důkazy o způsobu interakce paromomycinu, zástupce aminoglykosidů třídy neomycinu, s 27nukleotidovým RNA templátem, který byl navržen tak, aby napodoboval oblast A-site 16S rRNA v E. coli (obr. 3A). Návrh RNA templátu vycházel z předchozích poznatků, že paromomycin interaguje s párem bází C1407 – G1494, A1408, A1493 a U1495 a že tyto báze jsou naprosto nezbytné pro vysokoafinitní vazbu (39) (na obr. 3A jsou znázorněny šedě). Důležité jsou také další strukturní rysy, jako je kapsa vytvořená asymetrií v oblasti vnitřní smyčky v důsledku přítomnosti A1492 a párování bází C1409 – G1491 v oblasti dolního kmene. Tyto strukturní charakteristiky společně vytvářejí kapsu, která je optimální pro vazbu paromomycinu (viz níže).

V nativní šabloně RNA s místem A má kmen interakce párování bází na U1406 – U1495 (nekanonické) a C1407 – G1494 (obr. 3A). Po navázání paromomycinu se odlišná struktura tvořená A1408, A1492 a A1493 stabilizuje (obr. 2B) a báze A1408 a A1493 tvoří nekanonický pár bází (12, 39). Nukleotid A1492, který nemá žádné interakce s párem bází, vytváří ve struktuře RNA zalomení a kombinovaný účinek A1492 a páru bází A1408 – A1493 vytváří v místě A vyboulení, na které se váže paromomycin a dále prodlužuje úhel zalomení (obr. 2B). Funkční skupiny na paromomycinu, jako jsou hydroxylové a aminoskupiny, se účastní specifických interakcí s molekulou RNA (viz níže).

Kapsa vytvořená A1492 a párem bází A1408 – A1493 je obsazena kruhem II paromomycinu a tento kruh se naskládá nad bázi G1491 (na obr. 2B znázorněno žlutou šipkou) (12). Prstenec I paromomycinu navazuje specifické kontakty s „univerzálně“ konzervovanými páry bází U1406 – U1495 a C1407 – G1494 v rRNA. Je pozoruhodné, že kruh I je naprosto nezbytný pro specifickou vazbu aminoglykosidových antibiotik na rRNA. Prstence III a IV paromomycinu rozšiřují tyto interakce dále do hlavní drážky rRNA. Amino a hydroxylové části většinou přispívají k nespecifickým interakcím paromomycinu s rRNA; nejedná se tedy o interakce závislé na sekvenci. Dalším důležitým bodem je, že pár bází C1409 – G1491 poskytuje místo pro vazbu aminoglykosidu v kapse a neshodný pár bází v této pozici vede ke ztrátě vazby (12). Obecně se aminoglykosidy, které s paromomycinem sdílejí strukturní rysy, vážou na rRNA podobně (13). Zdá se však, že různá aminoglykosidová antibiotika se vážou na stejné vazebné místo ve více než jedné konformaci (28). Konformace aminoglykosidu, který se váže na RNA, musí v podstatě splňovat elektronická a sterická omezení vazebného místa. V jiné studii komplexu gentamicinu Cla a RNA templátu v místě A vykazovaly kruhy I a II gentamicinu Cla (které jsou podobné kruhům paromomycinu) podobné vazebné interakce jako v komplexu paromomycinu a RNA templátu v místě A (57). Kroužek III gentamicinu Cla však interaguje s páry bází U1406 – U1495 a G1405 – C1496 v horní oblasti kmene (obr. 3A). Na základě těchto pozorování Puglisi a spolupracovníci (57) navrhli, že všechny aminoglykosidy, které cílí na A-site 16S rRNA, se vážou společným způsobem, podobně jako kruhy I a II u paromomycinu a gentamicinu.

Ačkoli je celková struktura rRNA evolučně konzervována mezi všemi druhy, existují rozdíly, které činí vazbu aminoglykosidů specifičtější – nejméně 10krát vyšší afinitou k rRNA prokaryot než k rRNA eukaryot (19, 35, 38). To není velký rozdíl ve vazebné afinitě a může částečně vysvětlovat toxické účinky těchto antibiotik v savčích systémech. Eukaryotická rRNA obsahuje guanin na místě A1408, čímž vzniká pár bází G1408 – A1493. Kromě toho se u eukaryot nevyskytuje odpovídající pár bází C1409 – G1491. Tyto rozdíly společně vedou ke snížené afinitě aminoglykosidů k eukaryotické rRNA (12, 19, 35, 38). Po nastínění těchto rozdílů vazba aminoglykosidů na místo A rRNA u prokaryot mění konformaci místa A a ovlivňuje specifické interakce mRNA a tRNA v tomto místě, což vede k nepravidelným interakcím mezi kodony a antikodony. Dosud existuje málo strukturních informací o specifikách těchto interakcí na ribosomální úrovni (viz níže), ale jasným a konečným důsledkem je narušení procesu translace.

Další strukturní studie byla provedena na vazbě tobramycinu (obr. 1) na aptamer RNA (23). RNA aptamer, který byl v této studii použit, byla 26nukleotidová kmenová smyčka RNA (obr. 3B). V tomto RNA aptaméru jsou čtyři dvojice neshod, U7 – G20, G8 – U19, G9 – A18 a U11 – U16, které jsou součástí zipové vlásenkové smyčky. Tobramycin se váže v této drážce částečně zapouzdřené povrchem hluboké drážky a guaninovou bází zbytku G15 (obr. 4). V tomto komplexu se kruh I tobramycinu nachází na dně hluboké drážky. Jedna z aminoskupin na kruhu II tobramycinu interaguje s fosfátovou páteří v hlubokém žlábku a druhá aminoskupina je vystavena rozpouštědlu. Prstenec III je umístěn ve středu hlubokého žlábku a jeho hydroxylové skupiny směřují ke dnu žlábku. Předpokládá se, že výše popsaná konformace aptameru RNA je podobná konformaci vlásenkových smyček v tRNA a rRNA (23).

Rentgenová struktura funkčního komplexu T. thermophilus 70S rRNA obsahujícího tRNA a mRNA s rozlišením 7,5Å je užitečná pro přiblížení výše uvedené diskuse (5). Z této struktury si lze představit, jak dobře by do kompletní struktury rRNA zapadaly modelové studie s menšími templáty RNA, jako je aptamer tobramycin-RNA a A-site-RNA s paromomycinem (viz výše). Místo A v podjednotce 16S rRNA 70S rRNA je vidět v blízkosti rozhraní tRNA a podjednotky 50S rRNA, v blízkosti dvojice kodon-antikodon (obr. 2A). Po porovnání struktury roztoku RNA templátu s místem A v rentgenové struktuře 70S rRNA se ukázalo, že rentgenová struktura úzce souvisí s RNA templátem vázaným na paromomycin, ale ne s nativní strukturou roztoku RNA templátu s místem A (5). To je zajímavé a naznačuje to, že ve funkční formě možná vyboulení nebo zalomení v blízkosti bází A1492 a A1493 v 70S rRNA vždy existuje. Pokud by to byla pravda, znamenalo by to, že vazebná kapsa pro paromomycin existuje již v okamžiku, kdy se 70S rRNA stává funkční; je tedy předurčena k inhibici paromomycinem. To je v rozporu s tvrzením, že vazba paromomycinu zvyšuje úhel zalomení ve vazebném místě. Důkaz na podporu této myšlenky pochází z nedávné studie, která naznačila, že afinita různých aminoglykosidů k templátu RNA v místě A je různá a liší se i schopnost těchto antibiotik inhibovat syntézu proteinů in vitro (15). Gentamicin a několik dalších příbuzných antibiotik interaguje s RNA v místě A s disociačními konstantami (Kd) v mikromolárním rozmezí, ale inhibují proces translace in vitro s 50% inhibičními koncentracemi v nanomolárním rozmezí (15). Poslední zjištění bylo odvozeno jako důsledek vazby aminoglykosidu na intaktní rRNA v dekódovací oblasti (A-site) a rozdíl ve vazbě na intaktní rRNA oproti vazbě na templátovou RNA A-site může být způsoben rozdíly v konformacích těchto dvou RNA, jak bylo uvedeno výše.

A-site vytváří slabé kontakty s mRNA a tRNA, což naznačuje, že tato oblast hraje roli v rozpoznávání příslušné tRNA prostřednictvím jemných změn volné energie (5). Vazba aminoglykosidu v blízkosti tohoto místa může ovlivnit jemný proces interakcí mezi kodonem a antikodonem. Bylo také navrženo, že přítomnost aminoglykosidu stabilizuje komplex mRNA a tRNA v místě A, což následně ovlivňuje proces translace (5). Je obtížné odhadnout všechny účinky aminoglykosidů na strukturu rRNA a další strukturní studie s aminoglykosidy vázanými na komplexy, jako je 70S rRNA, budou užitečné pro objasnění a pochopení jemných změn, které vedou k antibiotickým účinkům aminoglykosidů.

Řada výzkumů použila syntetické sondy k pochopení interakcí mezi templáty RNA a aminoglykosidy. Předpokládá se, že aminoglykosidy se vážou na více než jedno cílové místo v ribozymu (6, 30). Nedávno bylo několik aminoglykosidových antibiotik, jako je neomycin B, tobramycin a kanamycin A, dimerizováno symetricky nebo asymetricky pomocí „tetheru“ a jejich vazebná afinita byla porovnána s afinitou monomerních mateřských aminoglykosidů (30). Předpokládalo se, že pokud je na RNA více vazebných míst, měly by se dimerizované aminoglykosidy vázat s vyšší afinitou než mateřské antibiotikum za předpokladu, že je přístupných více vazebných míst. Bylo skutečně zjištěno, že dimerizované aminoglykosidy se vážou na ribozymTetrahymena 20- až 1 200krát lépe než mateřské aminoglykosidy. Jedním z vysvětlení vyšší vazebné afinity by mohl být zvýšený počet kladně nabitých aminoskupin na dimerizovaném aminoglykosidu, ale tento efekt se zdá být synergický s entropickou výhodou získanou dimerizací (30). To také naznačuje přítomnost více vazebných míst s vysokou afinitou pro aminoglykosidová antibiotika v molekule RNA. Jiná studie se pokusila využít vazebných vlastností paromomycinu na RNA a interkalačního chování některých sloučenin, jako je pyren a thiazolová oranž (48). Tato strategie předpokládala aminoglykosidy jako prostředek pro dodání interkalujících látek do RNA. Konjugát paromomycinu s thiazolovým pomerančem nebo pyrenem vykazoval lepší vazebné vlastnosti na 27nukleotidový A-site RNA templát. Ve skutečnosti byla pro konjugát paromomycinu s thiazolovou oranží naměřena disociační konstanta 46 nM, což bylo uvedeno jako nejvyšší afinita, kterou rRNA A-site vykázala pro jakýkoli ligand.

Strukturální požadavky na vazbu aminoglykosidů na RNA naznačily, že pro umožnění vazby aminoglykosidů je nezbytné vyboulení v sekvenci RNA (7). Pomocí specifického derivátu kmenové smyčky RNA aptameru byla provedena řada studií chemické interference, chemických modifikací a mutací s cílem pochopit strukturní požadavky pro vazbu tobramycinu na RNA aptamer. Ukázalo se, že tento aminoglykosid interaguje hlavně s nukleovými bázemi v RNA aptameru, ale ne s fosfátovou páteří. Bylo však navrženo, že přítomnost výčnělku je důležitá pro vysokoafinitní vazbu tobramycinu ve stechiometrickém poměru, a byl učiněn závěr, že výčnělek vytváří dutinu pro interakci aminoglykosidu a nukleové báze (7). Tuto analogii lze aplikovat na další místa RNA, jako je oblast kladívkové hlavy a místo A, kde je dutina přítomna v důsledku nekanonického párování bází nebo smyček či výčnělků, které vytvářejí vhodné místo pro interakci aminoglykosidů s aniontovými fosfátovými skupinami a nukleovými bázemi. V souladu s tím Westhoff a jeho kolegové (49) předložili návrh, že interakce aminoglykosidů s RNA je pravděpodobně specifická spíše pro tvar než pro sekvenci.

V souladu s touto koncepcí byla elektrostatická pole v záhybech RNA považována za řídící sílu pro vazbu (viz níže). Hermann a Westhoff (20) byli schopni určit potvrzení dokování několika aminoglykosidových antibiotik v různých RNA templátech, jako jsou tobramycin-RNA aptamery a oblast A-site v 16S RNA, pro které byly k dispozici strukturní informace. Na základě těchto pozorování byl předpovězen způsob vazby aminoglykosidů na oblast transaktivačního elementu odpovědi v HIV (20). V další studii o RRE v HIV, vazebné oblasti pro protein Rev, Cho a Rando (8) zkoumali úlohu jednobázového výčnělku a dutiny pro vazbu aminoglykosidů. V souladu s předchozími hypotézami odvodili, že drážky v neduplexových oblastech RNA jsou důležité pro vysokoafinitní vazbu aminoglykosidů na RNA. V tomto případě vyboulení jedné báze nemělo vliv na vazbu, ale dutina, oblast bohatá na G sestávající ze dvou nekanonických párů bází a jednoho jediného vybouleného U, má vysokou afinitu k aminoglykosidům. Zásah do dutiny snížil afinitu RRE RNA k aminoglykosidům, což naznačuje, že nekanonické bázové páry obsahující výčnělky jsou primárními vazebnými místy pro aminoglykosidy v tomto RNA templátu (8).

.