Genová terapie pro nedědičné poruchy

Došlo k mnoha pokrokům v identifikaci mechanismů zapojených do chronického poškození orgánů, což otevřelo možnosti pro studie genové terapie . Zatímco se množství preklinických a klinických studií v posledních několika desetiletích zaměřilo na vývoj genové terapie pro dědičné poruchy, navzdory několika preklinickým studiím na zvířecích modelech bylo provedeno pouze několik klinických studií, které zkoumaly terapeutickou účinnost genové terapie pro nedědičné choroby. Nedávná studie ukazuje, že exprese telomerázy pomocí vektorů AAV9 má terapeutické účinky na myším modelu plicní fibrózy . Tato terapie byla zaměřena na idiopatickou plicní fibrózu. Je známo, že telomery fungují jako ochranné struktury na koncích chromozomů a bylo prokázáno, že přítomnost krátkých telomer je jednou z příčin vzniku onemocnění. Při tomto onemocnění jsou telomery příliš krátké, což vede k zastavení buněčného dělení, které následně vede k apoptóze buněk. Telomeráza je enzym, který dokáže restrukturalizovat délku telomer, a Povedano a jeho kolegové vyvinuli léčbu pomocí AAV sérotypu 9, který dodává telomerázu k nápravě krátkých telomer. Vzhledem k tomu, že AAV9 se přednostně zaměřuje na regenerační alveolární buňky typu II (ATII), vykazují myši ošetřené AAV9-Tert lepší funkci plic se sníženým zánětem a fibrózou po 1-3 týdnech od ošetření vektorem. Zajímavé je, že plicní fibróza se po 8 týdnech genové terapie buď zlepšila, nebo zmizela. Léčba AAV9-Tert vedla k delším telomerám a zvýšené proliferaci buněk ATII, stejně jako k nižšímu poškození DNA, apoptóze a senescenci.

Kardiální genová terapie odvozená od vektorů AAV se stává zcela novou platformou pro léčbu srdečních poruch . Genová terapie AAV pro srdeční selhání byla ověřena v preklinických studiích na zvířecích modelech a naprostá většina těchto přístupů byla provedena za účelem zlepšení manipulace s vápníkem kardiomyocyty. Terapeutickým proteinem použitým ve většině těchto studií byla sarkoplazmatická vápníková ATPáza (SERCA2a). Na základě pozitivních preklinických zjištění byla provedena první klinická studie (CUPID trial: calcium upregulation by percutaneous administration of gene vector in cardiac disease, NCT02346422) s cílem dodat SERCA2a pomocí vektoru AAV sérotypu 1 k léčbě pacientů s pokročilým srdečním selháním . Výsledek této studie fáze 1 byl úspěšný bez nežádoucích účinků a postoupil do studie fáze 2a, která poskytla slibné výsledky s výrazně nízkou mírou nežádoucích účinků. Výsledky klinické studie fáze 2b (studie CUPID2b, NCT01643330) s použitím stejného vektoru však byly neuspokojivé, bez významné změny mezi léčenou skupinou a skupinou s placebem . To vedlo k zastavení náboru pacientů pro další dvě studie s použitím AAV1.SERCA2a . Zajímavé je, že se chystají dvě nové studie zaměřené na dodání S100A1 pomocí vektoru AAV9 a konstitutivně aktivní formy inhibitorů proteinové fosfatázy 1, I1c, s chimerickou kapsidou se sérotypy AAV2 a AAV8 . Kromě toho se AAV1, AAV6 a AAV9 ukázaly jako nejslibnější sérotypy AAV pro přenos srdečních genů, což dává naději na úspěšné přístupy genové terapie k léčbě srdečního selhání v budoucnu.

Byly také zaznamenány přístupy genové terapie zprostředkované AAV k léčbě neuropatické bolesti u hlodavců . Fischer a jeho kolegové prokázali, že podání rAAV exprimujícího gen CBD3 (Ca2+ channel-binding domain 3) významně snížilo bolestivé chování, jako je hyperalgezie po dotyku špendlíkem nebo citlivost na stimulaci acetonem u zvířecích modelů zánětlivé a neuropatické bolesti . Jiná studie s použitím vektoru AAV9 kódujícího krátkou vlásenkovou RNA (shRNA) proti vaniloidnímu receptoru 1 (TRPV1), který je důležitým cílovým genem pro akutní bolest, prokázala, že tato terapie zmírnila tepelnou alodynii vyvolanou poraněním nervu (zvýšená reakce neuronů) 10-28 dní po léčbě na myším modelu šetřeného nervového poranění (SNI) . Tyto výsledky poskytují pozitivní důkazy, které povzbuzují výzkumníky v oblasti genové terapie k vývoji léčby založené na vektorech AAV pro pacienty s chronickou/diabetickou neuropatickou bolestí.

Výrazného pokroku bylo dosaženo v přístupu genové terapie k léčbě chronické fibrózy jater. Ačkoli inhibitory angiotenzin konvertujícího enzymu (ACE) nebo blokátory angiotenzinových receptorů (ARB) jsou široce používány jako léčba u pacientů s hypertenzí, byly zkoušeny i u pacientů s chronickým onemocněním jater; výsledky však nebyly přesvědčivé především proto, že vyvolávají nežádoucí systémové vedlejší účinky . Vzhledem k nedostatku medikamentózní léčby se transplantace jater nevyhnutelně stala jedinou možností pro pacienty s konečným stadiem jaterního onemocnění, které je důsledkem chronické jaterní fibrózy a/nebo cirhózy. Rostoucí výskyt chronického jaterního onemocnění, nedostatek dárcovských orgánů, potransplantační komplikace a vysoké náklady při transplantaci jater navíc znamenají, že existuje velká potřeba objevit a formulovat specifické, účinné, bezpečné a levné nové terapie jaterní fibrózy/cirhózy.

Jedním z možných přístupů, jak tento problém obejít, je vyvinout orgánově cílené antifibrotické strategie. Studie z naší laboratoře naznačily, že jedním z možných cílů je „alternativní osa“ systému renin-angiotenzin (RAS), zahrnující jeho klíčový enzym angiotenzin konvertující enzym 2 (ACE2), který rozkládá silný profibrotický oktapeptid angiotenzin II (Ang II) na antifibrotický heptapeptid angiotenzin-(1-7) (Ang-(1-7)) . Důkazy z experimentálních studií na zvířatech ukázaly, že rekombinantní lidský ACE2 (rhACE2) je prospěšný pro prevenci hypertenze u kardiovaskulárních onemocnění a pro zlepšení funkce ledvin u diabetické nefropatie . Je zajímavé, že rhACE2 byl dobře snášen skupinou zdravých lidských dobrovolníků v klinické studii fáze 1, aniž by vyvolával nežádoucí kardiovaskulární vedlejší účinky . Existuje jedna studie, která zaznamenala terapeutické účinky rekombinantního ACE2 u experimentální fibrózy jater, u níž bylo poškození jater chirurgicky vyvoláno cholestázou nebo hepatotoxickou injekcí tetrachlormethanu . Prokázali, že rekombinantní ACE2 významně snížil jaterní fibrózu v obou zvířecích modelech jaterního onemocnění . Hlavní nevýhodou tohoto systémového přístupu je však to, že léčba nevyhnutelně vyvolává účinky mimo cíl, které jsou v mnoha případech nežádoucí. Systémové podávání rekombinantního ACE2 má tedy několik nevýhod. Patří sem každodenní injekce ACE2, což je postup, který je v klinickém prostředí invazivní a nákladný přístup s nežádoucím vlivem na regulaci krevního tlaku . Aby se tento problém obešel, bylo by ideálním přístupem zvýšení tkáňově specifických hladin ACE2 v cílovém orgánu. Očekává se tedy, že orgánově specifické zvýšení aktivity ACE2 pomocí jaterně specifického rekombinantního vektoru AAV přinese terapeutické účinky omezené na cílový orgán a zároveň minimalizuje nežádoucí účinky mimo cíl.

Kromě použití jaterně specifického sérotypu kapsidy lze specifitu dále zvýšit inženýrstvím vektoru s genem ACE2 pod transkripční kontrolou silného jaterně specifického promotoru, apolipoproteinu E/lidského α1-antitrypsinu. Studie publikované naší laboratoří použily pseudotypizovaný vektor AAV specifický pro játra (rAAV2/8) pro preklinické hodnocení a zjistily, že jaterní overexprese myšího genu ACE2 dodaného myším trvala až 6 měsíců po jedné intraperitoneální injekci. Poté jsme myším aplikovali řadu modelů jaterních onemocnění, které zahrnovaly biliární fibrózu vyvolanou podvázáním žlučových cest (BDL), toxické poškození vyvolané injekcí tetrachlormethanu (CCl4) a jaterní fibrózu spojenou se ztučněním jater vyvolanou podáváním diety s nedostatkem methioninu a cholinu (MCD) pomocí jedné intraperitoneální injekce rAAV2/8-ACE2 . Léčba vedla k výraznému zvýšení exprese a proteinové aktivity ACE2, které bylo omezeno na játra, aniž by ovlivnilo ostatní hlavní orgány. Na rozdíl od dědičných poruch, například hemofilie B, kde může být relativně nízká úroveň exprese transgenu v játrech dostatečná pro následné malé zvýšení hladiny FIX v krvi , může být velikost exprese transgenu potřebná pro terapeutický zásah u nedědičných onemocnění podstatně vyšší. To zase může představovat výzvu pro výzkumné pracovníky zabývající se genovou terapií. Je však zajímavé, že v našem terapeutickém přístupu zaměřeném na játra pomocí rAAV2/8-ACE2 jsme zjistili, že zvýšená jaterní exprese ACE2 snížila jaterní hladinu profibrotického Ang II o více než 50 % ve srovnání s osobami léčenými kontrolním vektorem, který nesl lidský sérový albumin (rAAV2/8-HSA) . Snížení Ang II, které bylo doprovázeno zvýšením jaterních hladin antifibrotického peptidu Ang-(1-7), vedlo k výraznému snížení exprese zánětlivých cytokinů, což vedlo k hlubokému snížení jaterní fibrózy u všech tří modelů (obr. 2) . Tyto studie s krátkodobými zvířecími modely byly dále ověřeny a poskytly důkaz, že v dlouhodobých zvířecích modelech biliární fibrózy a tukové choroby jater, které vytvářejí jaterní léze srovnatelnější s těmi, které jsou pozorovány u pacientů s těmito chorobami, způsobila jediná intraperitoneální injekce rAAV2/8-ACE2 hluboké snížení jaterní fibrózy (obrázek 3). Na rozdíl od jiných studií využívajících vektory AAV jsme zjistili, že rAAV2/8-ACE2 snižuje sérové hladiny alanin-transaminázy (ALT) u nemocných zvířat ve srovnání se zvířaty, která dostala kontrolní vektor (rAAV2/8-HSA), což naznačuje, že samotný vektor je v játrech bezpečný. Navíc vektor rAAV2/8-HSA (do 10 dnů) nebo rAAV2/8-ACE2 (do 24 týdnů) injikovaný zdravým myším nezpůsobil žádnou změnu plazmatické hladiny ALT, což potvrzuje, že samotný vektor pravděpodobně nezpůsobuje poškození jater . Schematické znázornění molekulárního mechanismu spojeného s genovou terapií ACE2 pomocí vektoru rAAV2/8 u jaterní fibrózy je uvedeno na obrázku 4.

Cílený přenos genů do jater pomocí vektoru rAAV2/8 se ukázal jako terapeuticky slibný v dospělých játrech, ale jejich účinky v nezralých játrech nebyly dosud rozsáhle zkoumány. Ačkoli rAAV2/8 transdukuje neonatální myší játra s vysokou účinností, vektor není v játrech perzistentní a s růstem jater rychle klesá . Proto může úspěšné použití terapie zprostředkované rAAV2/8 k léčbě onemocnění jater v raném dětství vyžadovat opětovné podání . V souladu s tím jiná studie prokázala, že léčba neonatálních myší s deficitem ornitin-transkarbamylázy (OTC) pomocí terapie AAV2/8-OTC nedokázala myši ochránit před hyperamonémií v dospělosti . Vytvoření stabilní transdukce ve vyvíjejících se játrech tak zůstává jednou z největších výzev pro jaterně specifickou genovou terapii rAAV2/8 a k udržení terapeutické účinnosti v dospělosti po časné neonatální léčbě může být nezbytné opětovné podání vektorů.

Ačkoli vektory AAV použité pro preklinické studie mohou být účinné v lidských játrech, je důležité vybrat vektor AAV specifický pro lidské hepatocyty se zvýšenou účinností transdukce . Nedávno dvě skupiny navrhly použít humanizované myši, jako je imunosuprimovaný myší model FRG (Fah-/-/Rag2-/-/Il2rg-/-), k identifikaci nejlepšího sérotypu rAAV pro genovou terapii zaměřenou na játra . Studie na humanizovaném myším modelu repopulovaném více než 25 % lidských hepatocytů umožnily výzkumníkům identifikovat vektory AAV specifické pro lidská játra, jako je LK-03 odvozený z knihovny AAV s DNA kapsidou. Tato knihovna byla vytvořena pomocí 10 kapsidových genů AAV. LK-03, který se skládá z pěti různých rodičovských kapsid AAV, byl schopen transdukovat lidské primární hepatocyty s vyšší účinností in vitroa na modelu xenograftu hepatocelulárního karcinomu in vivov porovnání s AAV sérotypu 8 . Wang a jeho kolegové rovněž zaznamenali vyšší úroveň transdukce jater u myší FRG při použití kapsidy AAVrh10, AAV clade E pocházejícího z makaka rhesus, a AAV3B a prokázali, že vektory AAV-LK-03 mohou být lepší než AAV3B nebo AAV8 . Očekává se, že výzkumní pracovníci budou stále častěji používat humanizované zvířecí modely pro jiná onemocnění než onemocnění jater, což jim umožní identifikovat nové varianty upravených vektorů AAV, účinnost transdukce a imunitní reakce specifické pro zkoumanou lidskou tkáň. Kromě toho bylo zjištěno, že vektor AAV3B-eGFP, který byl schopen vyvolat jaterně specifickou robustní expresi GFP v játrech primátů, kteří nejsou lidmi, je výrazně lepší než AAV8 bez zjevné hepatotoxicity .

.