Proteiny musí interagovat s jinými proteiny, aby vytvořily funkční komplexy. V mnoha případech nelze funkci proteinů uvnitř buněk pochopit bez informací o struktuře proteinu a znalosti toho, v jakém komplexu se protein nachází.1, 2 To je například nesmírně důležité u proteinů, které modulují epigenetickou informaci na DNA. Téměř všechny tyto chromatin modifikující proteiny vyžadují intenzivní interakci s metabolickými enzymy, které poskytují kofaktory potřebné pro acetylaci, deacetylaci nebo metylaci a demetylaci histonů.3-5 To ukazuje na potřebu studovat komplexní prostředí daného proteinu pro analýzu jeho funkce a stavu aktivity. Zesíťování proteinů v kombinaci s analýzou pomocí hmotnostní spektrometrie (XL-MS) se ideálně hodí jako metoda pro získání informací o struktuře proteinů a složení proteinových komplexů.6-9 Pro XL-MS jsou zapotřebí specializovaná chemická činidla, zesíťovače, které jsou schopny kovalentně spojit zbytky proteinů, které se nacházejí v těsné blízkosti, například interagují v komplexu.10, 11 Charakterizace zesíťovaných peptidů pomocí hmotnostní spektrometrie však představuje obrovskou výzvu ze dvou důvodů. Zaprvé, identifikace příčných vazeb musí být dosažena analýzou fragmentových iontů nejen jednoho, ale dvou spojených peptidů, což značně komplikuje MS2 spektra. Za druhé, zesíťované peptidy mají jen velmi nízký výskyt a jsou součástí směsi peptidů, v níž převažují nezesíťované peptidy. V mnoha případech to vede k dramatické ztrátě informací, která brání přesné identifikaci síťových vazeb, a tedy i analýze interaktomu. Bylo vyvinuto několik síťovacích činidel, která zavedla MS-štěpitelné skupiny a možnost XL obohacení, aby se tyto problémy vyřešily.12-18

Předkládáme zprávu o vývoji nového síťovacího činidla, které je obohacené a má štěpné vlastnosti, které umožňují přesnou identifikaci síťování. Navržené činidlo cliXlink (1) je znázorněno na obrázku 1. Činidlo propustné pro buňky (obrázek 1 A a obrázek S1 v podpůrných informacích) obsahuje dvě sukcinimidylesterové jednotky, které mohou reagovat s nukleofily v proteinech a jsou od sebe vzdáleny zhruba 9 Å; umožňují tak fixaci na krátké vzdálenosti pro získání strukturních informací o proteinech a zachycení proteinů v těsné blízkosti. Účinné štěpení MS zajišťuje dobře zavedená sulfoxidová skupina, kterou lze štěpit za nízkoenergetických podmínek disociace vyvolané srážkou (CID) před fragmentací peptidu. Alkynová jednotka navíc umožňuje připojit k zesíťovaným místům pomocí reakce CuAAC obohacující část, například biotin.19

Použití zesíťovače může probíhat podle pracovního postupu znázorněného na obrázku 1 B. Zahrnuje přidání činidla 1 ke komplexnímu proteomu, fixaci informace o vzdálenosti peptidů v nativním stavu v těsné blízkosti a jejich zachování v průběhu dalšího pracovního postupu pro MS analýzu. Připojení afinitní skupiny pro obohacení se provádí po zesíťování, aby se zabránilo interferenci objemných obohacovacích skupin. Modifikací zesíťovaných peptidů na úrovni proteinu lze přebytečná nízkomolekulární činidla snadno odstranit srážením acetonem. Poté následuje enzymatické štěpení proteinů. Zesíťované peptidy jsou tímto způsobem označeny například biotinem, což umožňuje jejich obohacení. Poté se analyzují pomocí hmotnostní spektrometrie. Vzhledem k tomu, že jednotlivé hmotnosti peptidů v zesíťované vazbě nejsou okamžitě dostupné, je přiřazení zesíťované vazby obtížné, zejména u složitých vzorků. To vyžaduje použití činidel štěpitelných MS, která usnadňují identifikaci MS2 tvorbou specifických fragmentových iontů.20, 21 V nejlepším případě by činidlo mělo umožnit i MS3 experimenty, které vyžadují, aby byl síťovač rozštěpen dříve než peptidy. To umožňuje separovat peptidy pro individuální identifikaci na základě MS3. Naše činidlo 1 obsahuje atomy β-vodíku na obou stranách sulfoxidu, takže fragmentace probíhá ve dvou směrech, jak je znázorněno na obrázku 1 C. To vede k čistému oddělení peptidů (α, β) a generuje dva fragmenty pro každý peptid: alken a fragment kyseliny sulfenové; ten při ztrátě vody tvoří thial. Vzniknou tak dva hmotnostní páry s charakteristickým Δm/z≈32. Důležité je, že jsme pozorovali převahu fragmentační cesty a (obrázek 1 C). Pro α-peptid je tedy hlavním štěpným produktem alkenový fragment a pro β-peptid thialový fragment. Vzhledem k asymetrickým štěpným vlastnostem je většina intenzity signálu zachována na jednom fragmentu na peptid, což by mělo zajistit vynikající citlivost při MS3 experimentech.

Syntéza činidla 1 je jednoduchá (schéma 1). Výchozím bodem je oxidovaný disulfidický dimer homocysteinu 2, který se zpracuje s kyselinou 4-pentynovou, čímž vznikne disulfid 3. Redukčním štěpením disulfidu a alkylací vzniklých thiolů methyl 3-bromopropionátem vzniká sulfidická sloučenina 4. Saponifikací obou methylesterů na 5 a převedením 5 na aktivovaný bissukcinimidylester 6 a následnou oxidací thioetheru na sulfoxid se získá činidlo 1 v celkovém výtěžku 16 %. Důležité je zejména to, že činidlo je velmi čisté a reaktivní esterové jednotky jsou na obou stranách. Je třeba zabránit částečné hydrolýze. To bylo zajištěno závěrečným srážecím čištěním. Činidlo 1 bylo rozpuštěno ve směsi ethylacetátu a dichlormethanu a po přidání hexanu vysráženo.

Dále jsme zkoumali MS vlastnosti 1. Za tímto účelem jsme přidali 1 k běžně používanému modelovému proteinu, hovězímu sérovému albuminu (BSA). Postupovali jsme podle pracovního postupu znázorněného na obrázku 1 B bez provedení kroku obohacení. Stručně řečeno, po přidání 1 k roztoku proteinu a reakci po dobu 1 h při pokojové teplotě a fyziologickém pH jsme protein vysráželi acetonem, resuspendovali v pufru (viz podpůrné informace) a následně protein natrávili směsí trypsinu a Lys-C. Poté jsme protein rozpustili.

Získaná směs peptidů byla odsolena pomocí kolon C18 Tip a analyzována pomocí HPLC-MS2 (obr. 2). Na obrázku 2 A jsou jako příklad uvedeny dva zesíťované peptidy BSA (α+β). Po určení přesné hmotnosti neporušené příčné vazby (m/z 677,1; obrázek 2 B) jsme na prekurzoru provedli fragmentaci CID i HCD, abychom vyhodnotili fragmentační vlastnosti (obrázek 2 C). Selektivnější fragmentace CID (rezonanční excitace iontu příčné vazby; obrázek 2 C, horní spektrum) při nízké normalizované energii srážky 25 % poskytuje podle očekávání pouze malý soubor intenzivních signálů. Dva výrazné páry signálů s Δm/z 32 (Δmrep) jsou získány v důsledku fragmentace crosslinkeru, jejímž výsledkem je thialový (α-/β-thialový) a alkenový (α-/β-alkenový) fragment pro každý peptid. Jak již bylo uvedeno, upřednostňuje se fragmentační cesta a (obr. 1 C), která vede k asymetrickému rozložení intenzity. Dominantní tvorba očekávaných intaktních, separovaných peptidů následně činí činidlo vhodným pro sofistikovanější MS3 experimenty.

Pro naši studii jsme použili fragmentaci HCD. Tato metoda umožňuje současné štěpení příčné vazby a tvorbu peptidových fragmentů potřebných pro identifikaci (obr. 2 C, spodní spektrum). Pro pomoc při rozpoznávání příčných vazeb/peptidů je důležité, aby fragmentace HCD stále poskytovala alkenové a thiové fragmenty. Data HCD proto umožňují identifikaci peptidů pomocí MS2.

Při použití této metody jsme analyzovali data pomocí volně dostupného softwaru MeroX, přičemž jsme přísně filtrovali všechny identifikace příčných vazeb (skóre >50, míra falešného objevu (FDR) 1 %) a vyžadovali jsme přítomnost alespoň tří ze čtyř iontů ze dvou charakteristických hmotnostních párů.23, 24 Aniž bychom využili možnosti obohacení na základě CuAAC, byli jsme schopni identifikovat 61 jedinečných příčných vazeb BSA při jediném měření (obr. 2 D).25 Tento výsledek je reprezentativní pro měření prováděná s purifikovanou BSA v naší laboratoři. Kromě toho jsme znázornili příčné vazby nalezené v krystalové štuktuře BSA a zaznamenali, že většina naměřených vzdáleností byla přiměřená. Důležité je, že síťové vazby vykazují průměrnou vzdálenost Cα-Cα mezi zesíťovanými aminokyselinami 22,1 Å a rozložení vzdáleností, které je v naprosté shodě s tím, co se očekává pro síťování činidlem, které odděluje aktivní estery o přibližně 9 Å (obr. 2 E a S2)26 , a s přihlédnutím k délkám postranních řetězců a molekulární dynamice proteinu27. K síťování docházelo většinou mezi dvěma Lys zbytky (49 %), ale detekovali jsme také spojení Lys-Thr (30 %), Lys-Ser (13 %) a Lys-Tyr (8 %), což je v souladu s reaktivitou sukcinimidylových esterů (obr. 2 F).28

Tento úspěch nám umožnil ověřit nový síťovač ve složitějším prostředí. Chtěli jsme zejména ukázat další hodnotu možnosti obohacení na bázi CuAAC. Pro tento experiment jsme opět zesíťovali protein BSA (10 μg), vysráželi jej acetonem, znovu rozpustili zesíťovaný protein a následně provedli click reakci (obr. S3 A) přidáním 7 (obr. 3 A) a CuSO4/tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)aminu (THPTA) s následnou redukcí CuII na CuI po přidání askorbátu sodného. Po 1 h při pokojové teplotě jsme provedli další srážení acetonem, abychom odstranili přebytečný azid biotinu. Poté jsme přidali trypsin a Lys-C pro trávení.

Tyto peptidy jsme následně zkombinovali s proteinovým digestem získaným z extraktu buněk HEK (435 μg proteinu; obrázek 3 B). Tím vzniklo masivní pozadí nezesíťovaných peptidů. Pokud jsme nyní analyzovali síťované vazby v rámci tohoto velkého pozadí (obrázek 3 C), identifikovali jsme pouze velmi malý počet spektrálních shod síťovaných vazeb (průměr CSMs=5,0), unikátních síťovaných míst (průměr unikátních XLs=3,7) a také monolinky (průměr=5,3), u nichž jeden sukcinimidylester hydrolyzoval před reakcí s proteinem. Pokud jsme však provedli obohacení magnetickými kuličkami potaženými streptavidinem, počet identifikací příčných vazeb se výrazně zvýšil. Po inkubaci směsi peptidů s magnetickými částicemi; rozsáhlém promytí (6×) kuliček pufrem (viz podpůrné informace) a mírném, redukčním štěpení disulfidu za účelem uvolnění „zachycených“ příčných vazeb a tím odstranění biotinové části (obr. S3 B) jsme nyní v průměru detekovali 95,0 CSM a 37,0 unikátních XL spolu se 184,3 monolinky. Počet identifikovaných unikátních XL byl nižší než u purifikované BSA (obrázek 2 D), což lze vysvětlit neúčinností reakce CuAAC nebo interferencí pozadí nezesíťovaného komplexu. Tento výsledek však ukazuje, že náš nový síťovač 1 je schopen obohatit zesíťované peptidy v obrovském přebytku nemodifikovaných peptidů; usnadňuje tak analýzu komplexních vzorků s nízkým výskytem síťovaných vazeb. Původně jsme byli skeptičtí ohledně asymetrické struktury 1. Údaje však ukazují, že navzdory tomu je identifikováno velké množství křížových vazeb.

Shrnem lze říci, že náš nový síťovač 1 spojuje následující výhody: za prvé, velikost činidla je ideální pro získání cenných informací o vzdálenosti pro strukturní proteomiku. Kromě toho je molekula propustná pro buňky a alkynová jednotka nezpůsobuje významné rušení síťovací reakce. Robustní a účinná sulfoxidová fragmentace navíc zjednodušuje identifikaci síťové vazby. Možnost funkcionalizace peptidů zesíťovaných pomocí 1 pomocí click chemie umožňuje použití různých modifikací a strategií obohacování, které umožňují analýzu málo početných zesíťovaných vazeb. Závěrem lze říci, že naše činidlo 1 nyní otevírá cestu ke komplexní analýze interaktomu pomocí experimentů MS2 a MS3.

Střet zájmů

Autoři nehlásí žádný střet zájmů.