Účinky modafinilu na chování a parametry oxidačního poškození mozku potkanů kmene Wistar
Abstrakt
Byly hodnoceny účinky modafinilu (MD) na chování a oxidační poškození proteinů a lipidů v mozku potkanů. Potkanům kmene Wistar byla jednorázově podána voda nebo MD (75, 150 nebo 300 mg/kg). Behaviorální parametry byly hodnoceny na přístroji s otevřeným polem 1, 2 a 3 h po podání léku. V mozku byly měřeny reaktivní látky kyseliny thiobarbiturové (TBARS) a tvorba karbonylových bílkovin. MD zvýšil lokomotorickou aktivitu při nejvyšší dávce 1 a 3 h po podání. Podání MD v dávce 300 mg/kg zvýšilo návštěvy centra otevřeného pole 1 h po podání; 3 h po podání však všechny podané dávky MD zvýšily návštěvy centra otevřeného pole. MD v dávce 300 mg/kg zvýšil poškození lipidů v amygdale, hipokampu a striatu. Kromě toho MD zvýšil poškození proteinů v prefrontální kůře, amygdale a hipokampu; tento účinek se však liší v závislosti na podané dávce. Naproti tomu podávání MD 75 a 300 mg/kg snížilo poškození proteinů ve striatu. Tato studie prokázala, že podávání MD vyvolává změny chování, které byly závislé na použité dávce. Kromě toho se zdálo, že účinky MD na parametry oxidačního poškození se projevují ve specifických oblastech mozku a dávkách
1. Úvod
Modafinil (MD) je neamfetaminergní psychoaktivní léčivo často předepisované k léčbě spánku, jako je narkolepsie, syndrom obstrukční spánkové apnoe a poruchy spánku při práci na směny . Kromě toho je v literatuře dobře popsáno, že MD zlepšuje funkce v řadě kognitivních oblastí a také pracovní a epizodickou paměť . Tyto účinky MD na paměť byly popsány také u psychiatrických pacientů, což naznačuje, že tento lék je vynikajícím kandidátem na léčbu kognitivních dysfunkcí u psychiatrických poruch . Kromě toho klinický výzkum ukázal, že MD zlepšuje příznaky u pacientů s velkou depresí, bipolární poruchou, schizofrenií a poruchou pozornosti s hyperaktivitou (ADHD) .
Mechanismus účinku MD je málo známý; je však známo, že tento lék má významný vliv na katecholaminy, serotonin, glutamát, kyselinu gama amino-máselnou, orexin a histaminový systém v mozku . Kromě toho studie ukazují, že MD inhibuje dopaminový transportér, čímž zvyšuje dopaminergní neurotransmisi v okruzích bdělosti . Bylo prokázáno, že psychostimulancia, jako je amfetamin, která rovněž působí na různé neurotransmiterové systémy, mají výrazný vliv na chování, včetně vytváření strachu, úzkosti a hyperaktivity . MD je však méně spojen s vedlejšími účinky, jako je hyperaktivita, úzkost, nervozita nebo odrazové účinky, než je tomu u tradičních stimulancií .
Několik studií naznačilo, že podávání psychostimulancií může vést k oxidačnímu stresu v mozku potkanů. Mozek je obzvláště zranitelný vůči produkci reaktivních forem kyslíku (ROS), protože metabolizuje 20 % celkového množství kyslíku v těle a má omezenou antioxidační kapacitu . Chronické podávání psychostimulancií, jako je methylfenidát, m-amfetamin a d-amfetamin, u potkanů vyvolalo zvýšenou produkci superoxidu, oxidační poškození bílkovin, lipidů a DNA a změny v antioxidantech enzymů a komplexech mitochondriálního dýchacího řetězce .
Cílem této studie bylo proto vyhodnocení vlivu MD na chování a parametry oxidačního stresu v hipokampu, prefrontální kůře, amygdale a striatu potkanů.
2. Experimentální metody
2.1. Experimentální metody
2.2. Experimentální metody
2.3. Experimentální metody
2.4. Experimentální metody
2.5. Zvířata
2.3. Experimentální metody
2.4. Experimentální metody
2.5. Zvířata
Subjekty byli dospělí samci potkanů Wistar (hmotnost 250-350 g) získaní z naší chovné kolonie. Zvířata byla umístěna po pěti v kleci s potravou a vodou dostupnou ad libitum a byla udržována v 12hodinovém cyklu světlo/tma (světla se rozsvěcela v 7:00) při teplotě °C. Všechny experimentální postupy byly prováděny v souladu se schválením místní etické komise pro používání zvířat na Universidade do Extremo Sul Catarinense. Všechny pokusy byly prováděny ve stejnou denní dobu, aby se předešlo cirkadiánním výkyvům.
2.2. Pokusy byly prováděny ve stejnou denní dobu. Léčiva a farmakologické postupy
Léčiva (Libbs Farmacêutica Ltda) byla zavěšena ve vozidle-vehikulu: 1 % methylcelulosa ve vodě. Roztoky byly připraveny bezprostředně před použitím a během experimentálního sezení byly chráněny před světlem. Suspendovaný roztok byl po celou dobu injekce míchán. Kontrolní skupina dostala vehikulum
2.3. Experimentální design
Celkový počet potkanů použitých v tomto experimentu byl 40 ( zvířata v každé skupině). Zvířata dostala jednorázovou dávku MD (75, 100 nebo 300 mg/kg tělesné hmotnosti) v objemu 1 ml/kg, podávanou kanylou. Kontrolní skupina dostávala vehikulum v objemu 1 ml/kg. Lokomotorická aktivita byla měřena 1, 2 a 3 hodiny po injekci a potkani byli usmrceni dekapitací ihned po provedení úkolu na otevřeném prostranství.
2.4. Lokomotorická aktivita Potkani byli usmrceni dekapitací ihned po provedení úkolu na otevřeném prostranství. Lokomotorická aktivita
Lokomotorická aktivita byla hodnocena pomocí úlohy na otevřeném poli, jak bylo popsáno dříve . Tento úkol byl prováděn v otevřeném poli o rozměrech 40 × 60 cm obklopeném 50 cm vysokými stěnami z hnědé překližky, přičemž podlaha byla rozdělena černými čarami na 9 stejných čtverců. Zvířata byla opatrně umístěna na levý zadní obdélník a ponechána volně prozkoumat arénu po dobu 5 minut. V testu na otevřeném poli byly hodnoceny následující behaviorální parametry.
Přechody (lokomotorická aktivita/horizontální aktivita): počítal se celkový počet čtverců, které potkani přešli za celou dobu testu.
Zadní postoje (průzkumná aktivita/vertikální aktivita): počítal se celkový vzpřímený postoj potkanů za celou dobu testu.
Návštěvy středu otevřeného pole: počítal se celkový počet návštěv středu otevřeného pole. Středový čtverec o velikosti cm byl definován jako „středová“ plocha pole.
2.5. Návštěvy potkanů ve středu pole. Měření markerů oxidativního poškození
Potkani byli ošetřeni MD nebo vodou, jak je popsáno výše, a 3 h po poslední injekci byli usmrceni dekapitací a jejich mozky byly vyjmuty a pitvány pro hodnocení úrovně oxidativního poškození v prefrontální kůře, amygdale, hipokampu a striatu. TBARS a tvorba karbonylových bílkovin byly měřeny podle dříve popsaného postupu .
2.6. Reaktivní látky kyseliny thiobarbiturové (TBARS)
Tvorba TBARS během reakce kyselého zahřívání byla měřena jako index produkce ROS, který je široce přijímán jako citlivá metoda měření peroxidace lipidů, jak bylo popsáno dříve . Stručně řečeno, vzorky byly smíchány s 1 ml 10% kyseliny trichloroctové (TCA) a 1 ml 0,67% kyseliny thiobarbiturové (TBA) a poté zahřívány ve vroucí vodní lázni po dobu 15 min. TBARS byly stanoveny pomocí absorbance při vlnové délce 535 nm. Výsledky jsou vyjádřeny jako ekvivalenty MDA (malondialdehydu) (nmol/mg bílkovin).
2.7. Měření karbonylů bílkovin
Oxidační poškození bílkovin bylo hodnoceno stanovením karbonylových skupin na základě reakce s dinitrofenylhydrazinem (DNPH), jak bylo popsáno dříve . Stručně řečeno, bílkoviny byly vysráženy přidáním 20% kyseliny trichloroctové a znovu rozpuštěny v DNPH a absorbance byla odečtena při 370 nm
2.8 . Statistická analýza
Všechny analýzy byly provedeny pomocí statistického balíku pro sociální vědy verze 19.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Všechny údaje jsou prezentovány jako průměr ± SEM. Rozdíly mezi skupinami v behaviorální analýze byly ověřeny pomocí analýzy opakovaných měření rozptylu pro přístup ke křivce časové odezvy, po níž následovaly Tukeyho post hoc testy. K testování rozdílů mezi skupinami v biochemické analýze jsme použili ANOVA s následnými Tukeyho post hoc testy. Ve všech experimentech byly hodnoty < 0,05 považovány za ukazatele statistické významnosti.
3. Výsledky
3.1. Analýza chování
Při analýze lokomoce (přechody) (obr. 1(a)) odhalila analýza rozptylu opakovaných měření významné rozdíly pro podávání MD (F(3,35) = 7,91, ) a pro opakování chování (F(2,7) = 54,82, ). Další analýza s Tukeyho post hoc testem ukázala, že MD v dávce 300 mg/kg zvýšil spontánní lokomoci potkanů ve srovnání s kontrolní skupinou 1 h po podání. Kontrolní skupina, skupina s MD v dávce 75 mg/kg a skupina s MD v dávce 150 mg/kg navíc vykazovaly snížený počet přechodů, když byly o 3 h později znovu vystaveny působení otevřeného pole, což svědčí o habituaci na prostředí. Potkani, kterým byl podán MD v dávce 300 mg/kg, však vykazovali snížený počet přechodů, když byli znovu vystaveni působení prostředí o 2 a 3 hodiny později. Tento rozdíl lze vysvětlit motorickou hyperaktivitou vyvolanou 1 h po podání MD v dávce 300 mg/kg.
(a)
(b)
(c)
(a)
(b)
(c)
Pro analýzu explorace (rearings) (obr. 1b) odhalila analýza opakovaných měření variance významné rozdíly pro opakování chování (F(2,7) = 32,7, ). Další analýza s Tukeyho post hoc testem ukázala, že kontrolní skupina, MD v dávce 75 mg/kg a MD v dávce 150 mg/kg vykazovaly snížený počet přebalení, když byly po 3 hodinách opětovně exponovány na volném prostranství. MD v dávce 300 mg/kg snížil počet přeběhů, když byla skupina znovu vystavena pobytu na volném prostranství o 2 a 3 hodiny později.
Pro analýzu návštěv středu volného prostranství (obrázek 1 c)) odhalila analýza rozptylu s opakovanými měřeními významné rozdíly pro podávání MD (F(3,34) = 15,70, ). Další analýza s Tukeyho post hoc testem ukázala, že MD v dávce 300 mg/kg zvýšil počet návštěv středu otevřeného pole ve srovnání s kontrolou 1 h po podání. Kromě toho MD ve všech podávaných dávkách zvýšil návštěvy středu otevřeného pole 3 h po podání.
3.2. MD ve všech podávaných dávkách zvýšil návštěvy středu otevřeného pole 3 h po podání. Biochemická analýza
Jak ukazuje obrázek 2(a), hladiny TBARS byly významně zvýšeny v amygdale (F(3) = 4,18, ), hipokampu (F(3) = 44,9, ) a striatu (F(3) = 7,07, ) potkanů léčených MD v dávce 300 mg/kg ve srovnání s kontrolní skupinou.
(a)
(b)
(a)(b)
(b)
(a)
(b)
Jak je patrné z obrázku 2b, bylo zjištěno významné zvýšení tvorby karbonylu po podání MD v prefrontální kůře (F(3) = 29,9, ) při dávce 300 mg/kg a v amygdale (F(3) = 9,74, ) a hipokampu (F(3) = 17,99, ) při dávce 75 mg/kg. Naopak léčba MD v dávkách 75 a 300 mg/kg významně snížila tvorbu karbonylu ve striatu (F(3) = 21,93, ) ve srovnání s kontrolní skupinou.
4. Diskuse
V této studii jsme pozorovali, že jednorázová injekce MD ve vysoké dávce (300 mg/kg) vyvolává u potkanů hyperlokomoce, které nezůstávají 2 a 3 hodiny po podání. Podle našich výsledků MD významně zvýšil lokomotorickou aktivitu a zvýšil striatální extracelulární hladiny dopaminu u opic rhesus . Young a jeho kolegové prokázali, že MD zvyšuje aktivitu, vzrůst a plynulost lokomočních drah u myší C57BL/6J a 129/SJ. Tyto změny chování vyvolané MD souvisely se zvýšením synaptického dopaminu a sekundárními účinky zprostředkovanými dopaminovými receptory drd1 a drd4. Na rozdíl od výše uvedené studie, přestože je zde patrný trend, nepozorujeme významné zvýšení exploračního chování po podání MD. Tuto diskrepanci lze vysvětlit rozdíly v metodice, druhu a době léčby.
Zde jsme pozorovali, že kontrolní skupina a MD v nízkých dávkách (75 a 150 mg/kg) snížily počet přebíhání a přebíhání zezadu při opětovné expozici o 3 hodiny později v otevřeném poli, což ukazuje na habituaci na prostředí. MD ve vysoké dávce (300 mg/kg) snížil počet přeběhnutí a přeběhnutí, když byl po 2 a 3 hodinách znovu vystaven volnému prostranství. Tento rozpor lze vysvětlit tím, že 1 hodinu po podání MD (300 mg/kg) se výrazně zvýšil počet přeběhnutí a tendence ke zvýšení počtu přeběhnutí. Předpokládá se, že habituace na nové prostředí je jednou z nejzákladnějších forem neasociativního učení. Opakovaná expozice stejnému prostředí vyvolává snížení exploračního chování, které lze považovat za index habituace .
Zajímavým zjištěním této studie bylo, že MD moduloval chování související s úzkostí. Při testu v otevřeném poli byli potkani léčení MD méně úzkostní a dokonce měli tendenci zkoumat oblast averzivního centra více než kontroly. MD v dávce 300 mg/kg zvýšil počet návštěv středu otevřeného pole 1 hodinu po podání. Kromě toho MD ve všech podávaných dávkách zvýšil počet návštěv středu otevřeného pole 3 h po podání. V literatuře jsou studie o vlivu MD na úzkost rozporuplné. Preklinické studie neprokázaly buď žádné účinky modafinilu na úzkost, nebo anxiolytický účinek . Podobně MD v klinických studiích vykazuje buď anxiolytický účinek, nebo žádný účinek na úzkost , zatímco jiné prokazují anxiogenní účinek . Tento rozdíl mezi studiemi lze vysvětlit rozdíly v použitých dávkách (100 mg, 200 mg nebo 400 mg) a ve schématu dávkování (jednorázové versus chronické dávkování po dobu jednoho týdne nebo déle). Účinky MD podobné anxiolytickým lze vysvětlit jeho působením na amygdalu, což je oblast mozku, která se podílí na úzkosti, na ohrožující podněty. Předchozí studie ukázala, že MD snižuje reaktivitu amygdaly na strach nahánějící podněty . Je známo, že amygdala je bohatá na katecholaminergní a serotoninergní projekce , a pak pravděpodobně MD snižuje reaktivitu amygdaly změnami v intraamygdální signalizaci v důsledku změn v noradrenalinovém, dopaminovém, serotoninovém nebo GABA systému nebo kombinací těchto účinků.
Kromě vyvolání behaviorálních změn je v literatuře dobře popsáno, že psychostimulancia způsobují oxidační poškození na zvířecích modelech i u lidí . Naše výsledky ukazují, že MD zvyšuje oxidační poškození lipidů a proteinů v mozku potkanů. Hladiny TBARS byly zvýšeny v amygdale, hipokampu a striatu potkanů léčených MD ve vysoké dávce (300 mg/kg). Kromě toho jsme pozorovali zvýšení tvorby karbonylů po podání MD v prefrontální kůře při dávce 300 mg/kg a v amygdale a hipokampu při dávce 75 mg/kg. Studie ukazují, že MD inhibuje dopaminový transportér, čímž zvyšuje dopaminergní neurotransmisi . Zvýšení extracelulární koncentrace dopaminu vyvolané MD může vyvolat nadprodukci toxického metabolitu oxidace dopaminu , což vede k oxidačnímu poškození proteinů a lipidů v mozku potkanů. V literatuře neexistují studie hodnotící poškození mozku po podání MD; tyto studie jsou však velmi důležité vzhledem k tomu, že dostupnost MD, jako je lék zvyšující bdělost, paměť a proti únavě, pro zdravé lidi se zvyšuje .
Naopak léčba MD (75 a 300 mg/kg) snížila tvorbu karbonylu ve striatu ve srovnání s kontrolní skupinou. Některé studie prokázaly striatální neuroprotektivní potenciál MD. Předchozí studie ukazují zlepšení přežívání dopaminergních neuronů intoxikovaných 1-methyl-1,2,3,6-tetrahydropyridinem ve striatu po léčbě MD, a to na zvířecím modelu Parkinsonovy choroby . Raineri a jeho kolegové prokázali, že podávání MD zmírnilo neurotoxicitu vyvolanou metamfetaminem ve striatu myší, což naznačuje možnou ochrannou roli MD v této oblasti mozku. Bylo prokázáno, že MD zlepšuje učení u pacientů závislých na metamfetaminu . Zde prezentované výsledky naznačují, že podávání MD by mohlo vykazovat antioxidační vlastnosti ve striatu; ochranný účinek MD na striatum však dosud není znám. Striatum integruje glutamátergní vstupy z kůry a thalamu s dopaminergními aferenty ze středního mozku . Dopaminová signalizace hraje prvořadou roli ve striatálním závislém učení a v synaptické plasticitě středně ostnatých projekčních neuronů . Rossato a jeho kolegové prokázali, že infuze agonisty receptoru D1 zvyšuje hladinu neurotrofického faktoru odvozeného od mozku (BDNF) a následně synaptickou plasticitu . MD tedy může podporovat synaptickou plasticitu aktivací dopaminergního systému a následně chránit striatum před oxidativním poškozením.
Závěrem jsme schopni prokázat, že (1) MD vyvolává hyperaktivitu při vysoké dávce (300 mg/kg) 1 hodinu po podání, která nezůstává 2 a 3 hodiny po podání. (2) MD vykazoval u potkanů anxiolytické účinky a zvyšoval počet návštěv středu otevřeného pole. (3) MD vyvolal oxidační poškození lipidů a proteinů v mozku potkanů; oxidační poškození však závisí na analyzované oblasti mozku a podané dávce MD. (4) Nakonec MD mohl chránit striatum před oxidativním poškozením proteinů. Při interpretaci výsledků je třeba postupovat opatrně. Za prvé, nebyla měřena antioxidační obrana; jelikož se jedná o první studii, která zkoumá vliv MD na oxidační stres, uznáváme, že by to mohlo pomoci při interpretaci výsledků. Za druhé však byla MD podávána zdravým potkanům; účinky MD na oxidativní poškození u zvířecích modelů duševních onemocnění mohou vykazovat odlišné výsledky.
Konflikt zájmů
Autoři prohlašují, že v souvislosti s publikací tohoto článku nedošlo ke konfliktu zájmů.
Poděkování
Laboratoř neurověd (Brazílie) je jedním z center Národního institutu translační medicíny (INCT-TM) a jedním z členů Centra excelence aplikovaných neurověd v Santa Catarině (NENASC). Tento výzkum byl podpořen granty CNPq, FAPESC, Instituto Cérebro e Mente a UNESC. João Quevedo je výzkumným pracovníkem CNPq a Roger B. Varela, Wilson R. Resende a Amanda V. Steckert jsou držiteli studentského grantu CAPES; Samira S. Valvassori je držitelkou studentského grantu CNPq.