6.2.3 Cowpea Mosaic Virus

Cowpea Mosaic Virus (CPMV; Comovirus, Comoviridae) ist die am intensivsten untersuchte Plattform für verschiedene Konjugationen und biotechnologische Anwendungen. Es ist ein 30 nm großes, ikosaedrisches Virus und besteht aus einem zweiteiligen, einzelsträngigen RNA-Genom mit positivem Sinn, wobei jedes RNA-Molekül in einem separaten Partikel eingekapselt ist. Das CPMV-Kapsid besteht aus jeweils 60 Kopien von zwei verschiedenen CP-Untereinheiten (klein, 24 kDa, und groß, 42 kDa) mit pseudo T = 3 ikosaedrischer Symmetrie. Aufgrund der hochsymmetrischen und heteromeren Beschaffenheit des Kapsids bietet CPMV eine bemerkenswerte Möglichkeit, durch spezifisches genetisches und chemisches Engineering verschiedene Arten von Funktionalitäten (an fünffacher oder dreifacher oder an beiden Positionen) einzuführen, wobei sowohl die räumliche Verteilung als auch der Grad der Multivalenz kontrolliert werden können (Uchida et al., 2007; Young et al., 2008; Steinmetz, 2010; Wen et al., 2016). CPMV kann in großen Mengen aus infizierten Blättern gereinigt werden und ist in einem breiten Temperaturbereich (bis zu 60 °C) und im pH-Bereich von 3,0-9,0 stabil und widersteht einigen organischen Lösungsmitteln (Steinmetz et al., 2009). CPMV-Kapside werden für die kontrollierte Immobilisierung aktiver Enzyme verwendet. Die Verwendung von CPMV-Kapsiden für die schablonenhafte Herstellung von metallischen Nanopartikeln durch stromlose Abscheidung (ELD) und Mineralisierung durch eine Vielzahl von Prozessen ermöglichte die Herstellung von dünnen Schichten aus Metallen und Legierungen mit einheitlicher Dicke und Zusammensetzung. CPMV-Virionen werden als Nanobausteine für den kontrollierten Aufbau von 2-D- und 3-D-Strukturen mit einem Bottom-up-, Schicht-für-Schicht (LbL)-Ansatz für potenzielle Anwendungen als nanoelektronische Geräte oder elektrochemische Mehrfach-Biosensoren verwendet (besprochen in Culver et al., 2015; Wen et al, 2015a, 2016; Narayanan und Han, 2017a).

Native CPMV- und CPMV-Partikel, die mit Lanthanid-Metallkomplexen derivatisiert wurden, erwiesen sich als sicher und ungiftig, basierend auf Studien zur Biodistribution, Toxizität und Pathologie dieser Partikel in vivo (Rae et al., 2005; Singh et al., 2007). Es wurde festgestellt, dass CPMV während einer Infektion des zentralen Nervensystems (ZNS) bei Mäusen mit Entzündungsregionen und einer Störung der Blut-Hirn-Schranke in Verbindung gebracht wird (Shriver et al., 2009). CPMV mit Oberflächen-PEGylierung hat eine geringe Immunogenität gezeigt, und die Internalisierung wurde in mehreren Zelltypen durch eine Verringerung der unspezifischen Bindung verhindert (Raja et al., 2003). Manchester und Mitarbeiter entdeckten, dass fluoreszenzmarkiertes CPMV eine endogene Fähigkeit hat, von vaskulären Endothelzellen aufgenommen zu werden, und als intravitale Bildgebungssonde verwendet werden kann, um das Gefäßsystem und den Blutfluss bis zu einer Tiefe von 500 μm für 72 Stunden in lebenden Maus- und Kükenembryonen sichtbar zu machen (Lewis et al., 2006). Es wurde festgestellt, dass CPMV die natürliche Fähigkeit besitzt, an Oberflächen-Vimentin zu binden, ein Zytoskelettprotein, das die Architektur und Dynamik von Zellen moduliert, und dass es in Endothel-, Krebs- und Entzündungszellen überexprimiert ist (Koudelka et al., 2009). Die biokompatible, natürliche Interaktion mit Vimentin und die Endothel-Retentionsmerkmale von CPMV wurden weiter genutzt, um die Tumorangiogenese und das Tumor-Homing in vivo darzustellen (Leong et al., 2010; Steinmetz et al., 2011; Yildiz et al., 2011; Wen et al, 2015a).

Die äußere Oberfläche des CPMV-Kapsids wurde umfassend modifiziert, indem natürlich vorkommende oder gentechnisch hergestellte exponierte Lysin-, Cystein-, Tyrosin- sowie Asparagin- und Glutaminsäurereste mit Hilfe von standardmäßigen chemischen Konjugationsmethoden und konjugierenden Vernetzern zur Anbringung verschiedener Reagenzien wie Au-Nanopartikeln verwendet wurden, redoxreaktive Methylviogen-Komponenten, metallorganische Ferrocencarboxylat-Komponenten, Fluorophore, Biotin, PEG-Ketten, Stilbenderivate, Kohlenhydrate, heterologe Proteine (z.g., menschliches Holo-Transferrin, T4-Lysozym, das LRR-Domian von Internalin B und das Intron-8-Genprodukt des HER2-Tyrosinkinase-Rezeptors), Antikörper, Oligonukleotide, Halbleiter-Quantenpunkte und Fullerene. Der Einbau von unnatürlichen Aminosäuren in das CPMV-Kapsid erfolgte durch mehrere orthogonale chemische Verfahren (z. B. chemoselektive Hydrazon-Ligationsstrategie und kupferkatalysierte Azid-Alkin-Cycloaddition (CuAAC) oder „Click“-Reaktion). Diese Bemühungen haben die Verwendung von CPMV-Partikeln als optische Sonden, Impfstoffkandidaten sowie Speicher- und Sensor-Nanovorrichtungen ermöglicht (siehe Young et al., 2008; Destito et al., 2009; Grasso und Santi, 2010; Steinmetz, 2010; Lomonossoff und Evans, 2011; Wen et al., 2015a; Zhang et al., 2016; Lee et al., 2016b; Narayanan und Han, 2017a). CPMV und TMV wurden beladen, um Kontrastmittel für die duale Magnetresonanz- (MR) und optische Bildgebung zu tragen, und beide Modalitäten zeigten in vitro eine Spezifität der Fibrinbindung in Gegenwart von Targeting-Peptiden. Präklinische Studien in einem photochemischen Thrombosemodell der Halsschlagader bestätigten die Thrombusanlagerung der Nanosonden, wobei die länglichen TMV-Stäbchen eine deutlich stärkere Bindung an Thromben aufwiesen als ikosaedrische CPMV (Wen et al., 2015b,c). CPMV, das mit E7p72-Peptiden dekoriert ist (ein Peptid mit hoher Affinität zur epidermalen Wachstumsfaktor-ähnlichen Domäne 7 (EGFL7), das spezifisch auf menschliche Endothelzellen abzielt), zielt mit hoher Spezifität auf tumorassoziierte Neovaskulatur ab, wie durch intravitale Bildgebung festgestellt wurde (Cho et al., 2017).

In vitro- und in vivo-Montageprotokolle für CPMV-Kapsiduntereinheiten sind noch nicht gut etabliert. Dies hat sein Potenzial zur Verwendung als Nanocontainer für die Verkapselung von Frachtmolekülen eingeschränkt. Der native Nukleinsäuregehalt von CPMV-Virionen wurde als elektrostatischer Schwamm verwendet, um mittels einer einfachen Infusionstechnik Bildgebungsmittel und therapeutische Moleküle anzuziehen (Yildiz et al., 2013). Die transiente Koexpression des CPMV-Vorläufers (VP60), der aus fusionierten großen und kleinen Proteinen besteht, und der 24K-Proteinase zur proteolytischen Verarbeitung von VP60 in Pflanzen führte zu CPMV-VLPs (eCPMV), die völlig frei von RNA (entweder Virus oder Wirt) waren (Saunders et al., 2009). Solche leeren Kapsiden wurden verwendet, um eine Vielzahl von Frachtmolekülen zu transportieren, wie Metalle, Fluoreszenzfarbstoffe oder Medikamente (Culver et al., 2015; Wen et al., 2015a; Narayanan und Han, 2017a). Fluorophore, Biotin-Affinitäts-Tags, PEG und verschiedene Peptide wurden selektiv auf der inneren Oberfläche des leeren CPMV dargestellt, indem reaktive Lysine anvisiert wurden (Wen et al., 2012b). Die Wirksamkeit von eCPMV als In-situ-Impfstoff wurde in Mausmodellen von metastasierendem Melanom, Brustkrebs, Eierstockkrebs und Dickdarmkrebs nachgewiesen, wo es eine Antitumor-Immunantwort auslöste, indem es die Aktivierung und Infiltration von Neutrophilen auslöste, was zu einem Chemo-/Zytokinprofil führte, das zur Aktivierung der adaptiven Immunität führte. Die meisten Mäuse, die auf der gegenüberliegenden Flanke erneut mit Tumoren konfrontiert wurden, stießen den erneut konfrontierten Tumor vollständig ab (Lizotte et al., 2016). Die intratumorale Verabreichung von magnetischen Nanopartikeln (mNP) zur Induktion von Hyperthermie und eCPMV in Kombination verbesserte die lokale und systemische Wirksamkeit der Tumorbehandlung (Verlangsamung des sekundären Tumorwachstums (Abscopal-Effekt) und Resistenz gegen Tumor-Rechallenge) in den C3H-Maus/MTG-B-Mammaria-Adenokarzinom- und C57-B6-Maus/B-16-F10-Melanom-Zellmodellen (Hoopes et al., 2017a). Anhand von acht spontanen Hundekrebsen (zwei orale Melanome, drei orale Amelioblastome und ein Karzinom) konnten Hoopes et al. (2017b) zeigen, dass eine Kombination aus hypofraktionierter Bestrahlung, mNP-induzierter Hyperthermie und intratumoraler eCPMV-Behandlung eine verstärkte Immunantwort hervorruft.

Um CPMV für die gezielte Verabreichung von Medikamenten an Krebszellen zu nutzen und die natürliche Wechselwirkung zwischen CPMV und Säugetierzellen zu überwinden, wurde eine „Klick“-Reaktion verwendet, um PEG und einen Folat-Ligandenanteil (CPMV-PEG-FA) an CPMV zu konjugieren. Diese Konjugation ermöglichte die spezifische Ausrichtung von CPMV auf Folatrezeptoren (FRs) exprimierende HeLa- und KB-Zellen (Destito et al., 2007). Die Ausrichtung von CPMV auf Neuroblastom-Tumorzellen wurde erreicht, indem CPMV genetisch so modifiziert wurde, dass es das Neuropeptid Y (NPY)-Analogon als Targeting-Ligand aufweist. Es wurde gezeigt, dass das CPMV-NPY spezifisch mit SK-N-MC-Zellen interagiert, die den Y1-Rezeptor überexprimieren (Destito et al., 2009; Ma et al., 2012). Durch die Verankerung von kurzen Peptidsequenzen (F56 und Bombesin, die spezifisch für den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor-Rezeptor-1 (VEGFR-1) sind) bzw. Gastrin-releasing Peptid-Rezeptoren (GRPR) an CPMV wurde eine rezeptorbezogene Bildgebung erreicht. Diese CPMV-basierten Sensoren haben sich als spezifisch für die Bindung an Krebszellen erwiesen, die diese Rezeptoren auf der Zelloberfläche überexprimieren (Brunel et al., 2010; Steinmetz et al., 2011). Wen und Steinmetz (2014) entwickelten einen Bottom-up-Ansatz für die Synthese von CPMV-Nanopartikeln, Dimeren und Assemblies, die Targeting-Liganden (zyklische RGD-Peptide) und Fluoreszenzfarbstoffe enthalten, und stellten fest, dass die symmetrische Präsentation von RGD-Peptiden und die Dimerisierung von Nanopartikeln die Wirksamkeit des Krebszell-Targetings erhöht.

CPMV wurde erfolgreich für die Darstellung verschiedener heterologer Peptide verwendet, um eine Immunantwort auszulösen. Die Immunisierung von Tieren mit jeder der Chimären löste eine starke humorale Immunantwort aus, die vor einer Herausforderung durch den jeweiligen Erreger schützte. Die multivalente Darstellung von antiviralen Molekülen und Kohlenhydraten auf CPMV erleichterte ihre Verwendung für therapeutische Anwendungen (Lomonossoff und Evans, 2011; Koudelka et al., 2015; Hefferon, 2017). Aljabali et al. (2013) stellten eine kovalente Konjugation von Dox an CPMV entweder über eine Amidbindung oder eine Disulfidbrücke unter Verwendung von Lysin- oder Cysteinresten auf der äußeren Oberfläche des CPMV her. Das mit Dox beladene CPMV zeigte selbst bei niedriger Dosierung eine höhere zelltötende Wirkung als freies Dox. CPMV, das mit einer Korona aus negativ geladenen Dendronen modifiziert ist, wurde zur Beladung mit positiv geladenen Photosensibilisatoren (für die photodynamische Therapie (PDT)) verwendet. Dieses hybride PDT-CPMV-Trägersystem war wirksam bei der Abtötung sowohl von Melanomzellen als auch von Makrophagen in vitro (Wen et al., 2016). Um die dosisbegrenzenden unspezifischen Toxizitäten von dreiwertigem Chrom (einem nützlichen Mineralstoff) zu überwinden, das die Proliferation von glatten Muskelzellen der menschlichen Aorta (HASMC), die durch hohe Glukose induziert werden, in vitro selektiv hemmen kann, wurde Chromchlorid in den Träger geladen, Chromchlorid wurde durch Infusion in das Innere des CPMV eingebracht, und die daraus resultierenden CrCl3-beladenen CPMV-Partikel (CPMV-Cr) verringerten signifikant die Glukose-induzierte HASMC-Proliferation und zeigten antiatherogene Effekte unter hyperglykämischen Bedingungen (Ganguly et al., 2016).