Abstract

Nur wenige Studien wurden über die medizinische Flora der mexikanischen Halbinsel Yucatan auf der Suche nach neuen therapeutischen Mitteln, insbesondere gegen Krebs, durchgeführt. In dieser Arbeit haben wir das zytotoxische Potenzial des Extrakts von Bonellia albiflora untersucht, einer Pflanze, die in der traditionellen Maya-Medizin zur Behandlung chronischer Verletzungen im Mund verwendet wird. Wir haben die methanolischen Extrakte aus verschiedenen Teilen der Pflanze durch Extraktion mit dem Soxhlet-Gerät gewonnen. Wir führten Flüssig-Flüssig-Fraktionen für jeden Extrakt mit Lösungsmitteln zunehmender Polarität durch. Alle Extrakte und Fraktionen wurden auf ihre zytotoxische Aktivität gegenüber vier menschlichen Krebszelllinien und einer normalen Zelllinie mittels eines Tetrazolium-Farbstoff-Reduktionstests (MTT) in 96-Well-Zellkulturplatten untersucht. Der methanolische Wurzelrindenextrakt besaß eine viel größere zytotoxische Aktivität bei der menschlichen Oropharynx-Krebszelllinie (KB); seine Hexanfraktion konzentrierte die aktiven Metaboliten und induzierte Apoptose mit der Aktivierung der Caspasen 3 und 8. Die Ergebnisse zeigen das zytotoxische Potenzial der Hexanfraktion von B. albiflora und untermauern die Bedeutung der Untersuchung der traditionellen Maya-Heilpflanzen.

1. Einleitung

Die traditionelle Medizin ist eine Praxis, die von der Antike bis in unsere Zeit von den Bewohnern der indigenen Pueblos Mexikos ausgeübt wird, zu denen auch die Maya-Bevölkerung der Halbinsel Yucatan in Mexiko gehört. In der traditionellen Maya-Medizin sind Pflanzen von großer Bedeutung, was als Beweis für ihre Wirksamkeit bei der Bekämpfung vieler Arten von Krankheiten angesehen werden kann. Ebenso stellen sie eine der wichtigsten Alternativen für die Gesundheitsversorgung dar, vor allem in Gemeinden, in denen primäre Gesundheitsdienste nicht zugänglich sind. Darüber hinaus können sie als natürliche, erneuerbare Ressource in großem Umfang genutzt werden. Zusammen mit dem zuvor Beschriebenen wurde die traditionelle Medizin der indigenen Pueblos von der Weltgesundheitsorganisation (WHO) anerkannt, was einen starken Impuls für die Erforschung von Heilpflanzen auslöste.

Die ethnobotanische Literatur der Maya besteht größtenteils aus historischen oder beschreibenden Studien, in denen ein Kompendium von Krankheiten und Behandlungen vorherrscht, die den Maya-Heilern verschiedener Epochen bekannt waren. Die Maya kannten und behandelten verschiedene Krankheiten, darunter solche infektiösen Ursprungs (Darminfektionen, infektiöse Dermatitis und Atemwegsinfektionen), chronische Krankheiten (Asthma, Müdigkeit, Nephritis und Bluthochdruck) und psychische Krankheiten (Schlaflosigkeit, Nervosität und Hysterie). Außerdem heilten sie andere Krankheiten wie Abszesse, Schwielen, Hühneraugen, harte Auswüchse, Polypen, Tumore und Warzen oder Wunden, die in der Regel auf der Haut spürbar oder sichtbar sind.

In der traditionellen Maya-Medizin der Yucatan-Halbinsel ist „Krebs“ als eine Krankheit oder eine Reihe von Krankheiten bekannt, die sich als Befall der Haut oder der darunter liegenden Muskelmasse oder als Befall in Form von Schmerzen in einem inneren Organ äußern können. Der Begriff bezieht sich auf eine schwer zu heilende oder unangenehm aussehende Krankheit (wenn sie die Haut betrifft); handelt es sich um eine innere Krebserkrankung, verrät das Aussehen des Patienten die Krankheit. Die alten Bewohner haben diesen Symptomen in der Maya-Sprache Namen gegeben: „Krebs“ heißt in der Maya-Sprache „tsunuz“ oder „tsunuztacan“, und harte Wucherungen oder Tumore werden „chu’uchum“ genannt.

Vorangegangene Studien haben gezeigt, dass die Extrakte von Pflanzen, die in der traditionellen Maya-Medizin zur Behandlung von Anzeichen und Symptomen, die auf Krebs hindeuten, verwendet werden, eine zytotoxische Wirkung besitzen. In ähnlicher Weise haben zwei Studien, die an zwei Arten der Gattung Bonellia (Bonellia macrocarpa und Bonellia flammea) von der Halbinsel Yucatan durchgeführt wurden, das Vorhandensein neuartiger Verbindungen, wie z. B. Wirkstoffe mit antikanzerogener Aktivität, aufgezeigt. In diesem Zusammenhang gibt es auf der Halbinsel Yucatan fünf Arten der Gattung Bonellia, von denen die Arten B. macrocarpa, B. flammea und B. albiflora in der traditionellen Maya-Medizin für die Behandlung von Hautkrankheiten verwendet werden. Von diesen drei Arten ist nur B. albiflora nicht Gegenstand einer Studie über phytochemische oder biologische Aktivitäten gewesen. B. albiflora wird in der traditionellen Maya-Medizin als „Si’ik“ bezeichnet und als Hustenmittel zur Behandlung von Haut- und Mundwunden und zur Linderung von Zahnschmerzen verwendet. In dieser Arbeit haben wir eine Bewertung des zytotoxischen Potentials der organischen Extrakte von B. albiflora vorgeschlagen.

2. Materialien und Methoden

2.1. Pflanzenmaterial

Bonellia albiflora (Lundell) B. Ståhl und Källersjö wurde im Sommer 2010 an verschiedenen Orten im Bundesstaat Yucatan, Mexiko, gesammelt. Das Pflanzenmaterial wurde von Taxonomen der Abteilung für natürliche Ressourcen des wissenschaftlichen Forschungszentrums von Yucatan (CICY) identifiziert und authentifiziert.

2.2. Chemikalien

Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), hitzeinaktiviertes fötales Rinderserum (FBS) sowie Penicillin und Streptomycin (PS) wurden von Gibco, Carlsbad, CA, USA, bezogen. 3-(4-5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazoliumbromid (MTT), Dimethylsulfoxid (DMSO) und Etoposid wurden von Sigma, St. Louis, MO, USA, bezogen. Caspase-Assay-Kits und apoptotische DNA-Leiterkits wurden von BioVision Research Products, Palo Alto, CA, USA, erworben.

2.3. Extraktion und Fraktionierung

Jeder Pflanzenteil wurde getrennt, getrocknet und pulverisiert. Das getrocknete Pulver des abgetrennten Pflanzenmaterials (100 g) wurde in einem Soxhlet-Apparat bei 60°C mit Methanol (500 ml) erschöpfend extrahiert. Die Überstände wurden gefiltert und unter Vakuum mit einem Rotationsverdampfer eingedampft, um einen Trockenextrakt zu erhalten. Der Methanolextrakt jedes Pflanzenmaterials (10 mg) wurde in 20 mL Methanol : Wasser (1 : 3) suspendiert und nacheinander mit 50 mL Lösungsmitteln zunehmender Polarität extrahiert: Hexan, Dichlormethan und Ethylacetat, so dass der letzte Extraktrückstand eine wässrige Fraktion war. Der Fingerabdruck des aktiven Hexan-Extrakts (5 mg) wurde für die Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS) erhalten.

2.4. Zelllinien und Kultur

Zelllinien des Oropharynxkarzinoms (KB ATCC-CCL-17), des Larynxkarzinoms (Hep-2), des Adenokarzinoms des Gebärmutterhalses (HeLa ATCC-CCL-2) und des Plattenepithelkarzinoms des Gebärmutterhalses (SiHa ATCC-CCL-35), sowie eine normale Zelllinie, Hundezellniere (MDCK ATCC-CCL-34), aus der American Type Culture Collection (ATCC), wurden freundlicherweise von Veronica Vallejo-Ruíz vom East Biomedical Research Center-IMSS zur Verfügung gestellt. Die Zellen wurden in DMEM-Medium kultiviert, das 10 % SFB enthält und mit 100 Einheiten/mL Penicillin G und 100 μg/mL Streptomycin in 5 % CO2-95 % befeuchteter Luft bei 37 °C ergänzt wurde.

2.5. Zytotoxizitätstest

Die Zytotoxizität wurde mit dem MTT-Test nach der von Denizot und Lang beschriebenen Methode mit einigen Änderungen bestimmt. Wenn die Zellen >70% Konfluenz erreicht hatten, wurde das Medium ersetzt und die Zellen wurden mit dem in DMSO gelösten Extrakt (Höchstkonzentration von 0,05%) in einer Konzentration von 2,34 bis 300 g/mL behandelt. Nach 48 Stunden Inkubation wurden 10 μL MTT (5 mg/mL) in jede Vertiefung gegeben und 4 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Das Medium wurde entfernt und der Formazan-Niederschlag in 100 μL angesäuertem Isopropanol (0,4 N HCl) gelöst. Die optische Dichte wurde mit einem Spektrophotometer bei 540 nm bestimmt. Zellen, die mit 0,05 % DMSO und Docetaxel behandelt wurden, dienten als Negativ- bzw. Positivkontrollen. Die Konzentration des Extrakts, die 50 % der Zellen abtötet (CC50), wurde mit der Software GraphPad Prism 4.00 berechnet. Alle Bestimmungen wurden in dreifacher Ausführung durchgeführt. Die MDCK-Zelllinie wurde verwendet, um den Selektivitätsindex (SI) der Extrakte zu bewerten. Der SI ist definiert als das Verhältnis der zytotoxischen Aktivität von normalen Zellen und Krebszelllinien.

2,6. GC-MS-Analyse

Die chromatographische Trennung erfolgte durch GC-MS-Analyse mit einem Agilent-Gaschromatographen, Modell 6890N, gekoppelt an einen massenselektiven Detektor, Modell 5975B. Die Verbindungen wurden auf einer DB-5 ms-Kapillarsäule (30 m × 0,32 mm i.d., 0,25 μm Filmdicke) (J&W Scientific, Folsom, CA, USA) getrennt. Ein Mikroliter der Probe wurde im Split-Modus (50 : 1) in das GC-MS injiziert. Die Injektortemperatur betrug 250°C. Die Säulentemperatur wurde wie folgt programmiert: Anfangstemperatur 160°C für 3 min, 10°C/min bis 240°C, 240°C für 2 min, 5°C/min bis 250°C, 250°C für 10 min, 5°C/min bis 300°C und 300°C für 10 min. Die Bedingungen für den Massendetektor waren wie folgt: Elektronenstoß (EI)-Modus bei 70 eV; Quellentemperatur: 230°C; Abtastrate: 1 Scan/s; Massenerfassungsbereich: 20-600 amu; Lösungsmittelverzögerung, 4 min. Trägergas war Helium bei 1 mL/min. Die flüchtigen Komponenten wurden durch den Vergleich ihrer Massenspektren mit der NIST-Standardreferenzdatenbank Version NIST 05 für Windows vorläufig identifiziert. Ein authentischer Standard der Bonediolverbindung wurde freundlicherweise von Dr. Peraza-Sánchez vom CICY zur Verfügung gestellt.

2.7. Analyse der DNA-Fragmentierung

Die DNA-Fragmentierung wurde nach der von Tong et al. beschriebenen Methode bestimmt. Kurz gesagt, die Zellen wurden mit dem Extrakt in einer Konzentration von 10 und 50 μg/mL behandelt und 6, 12 und 24 Stunden lang inkubiert. Mit einem apoptotischen DNA-Leiter-Kit (BioVision apoptotic DNA ladder extraction kit) wurde die DNA nach dem Protokoll des Herstellers isoliert; die DNA in den Proben wurde auf einem 1,5 %igen Agarosegel mit 1 μg/ml Ethidiumbromid aufgetrennt. Die DNA-Banden wurden unter ultravioletter Beleuchtung sichtbar gemacht und fotografiert.

2.8. Bestimmung der Caspase-Aktivitäten

Die Aktivitäten der Caspasen 3, 8 und 9 wurden mit dem kolorimetrischen FLICE/Caspase-Assay-Kit gemäß den Protokollen des Herstellers bestimmt. Kurz gesagt wurden Zellen, die 6, 12 oder 24 Stunden lang mit 10 oder 50 μg/mL Extrakt behandelt worden waren, geerntet, mit PBS gewaschen und 10 Minuten lang bei 4 °C bei 800 ×g zentrifugiert. Die Zellpellets wurden in 50 μl Lysepuffer resuspendiert und 10 Minuten auf Eis inkubiert, bevor sie 1 Minute lang bei 10.000 ×g zentrifugiert wurden. Der Überstand wurde in einem 1,5-mL-Röhrchen aufgefangen und auf Eis gelagert. Nach der Messung der Proteinkonzentration wurden 200 μg Protein in 50 μl Zelllysepuffer aufgelöst. Der Reaktionspuffer mit 10 mM DDT wurde zu jeder Probe hinzugefügt. Schließlich wurde ein spezifisches Substrat für jede Caspase (DEVD-ρNA, IETD-ρNA und LEHD-ρNA) zu den Proben gegeben, 1 Stunde lang bei 37 °C inkubiert und bei 405 nm gemessen. Die Enzymaktivität wurde als Faktor im Vergleich zur Kontrollprobe ausgedrückt.

3. Ergebnisse und Diskussion

3.1. Zytotoxische Aktivität der methanolischen Extrakte

Die Ergebnisse der Zytotoxizität der methanolischen Extrakte aus verschiedenen Teilen von B. albiflora sind in Tabelle 1 zusammengefasst. Der methanolische Extrakt aus der Wurzelrinde zeigte die interessanteste zytotoxische Aktivität im Vergleich zu den Extrakten aus den Blättern und der Stammrinde von B. albiflora, mit einer CC50 von 12-31 μg/mL bei den vier menschlichen Krebszelllinien. Die KB-Zelllinie zeigte mit einer CC50 von 12,64 μg/mL eine größere Empfindlichkeit gegenüber dem Extrakt. Die nicht an Krebs erkrankte Hunde-Nieren-Zelllinie MDCK war weniger empfindlich gegenüber den Wirkungen des Extrakts mit einem SI von >5 bei den untersuchten Zelllinien (Tabelle 1). Das US-amerikanische National Cancer Institute (NCI) hat vorgeschlagen, dass Rohextrakte mit potenziell zytotoxischer Aktivität solche sind, die eine CC50 von ≤30 μg/mL aufweisen; daher wurde dieser Extrakt als wichtig für zukünftige Studien identifiziert. Diese Daten sind mit denen vergleichbar, die für aktive methanolische Extrakte aus B. macrocarpa-Wurzeln bei menschlichen Zelllinien ermittelt wurden: KB, Prostata-Adenokarzinom (PC3), Plattenepithelkarzinom des Gebärmutterhalses (SiHa), Brust-Adenokarzinom (MCF-7), Gebärmutterhals-Adenokarzinom (HeLa) und Kehlkopfkarzinom (Hep-2) .

Der Extrakt aus Blättern war die zweitgrößte Aktivität, nur auf KB-Zelllinie mit einer CC50 von 23.85 μg/ml nach den NCI-Kriterien, gefolgt von dem Extrakt aus der Stammrinde, der weniger zytotoxisch für die KB- und Hep-2-Zelllinien war.

3.2. Zytotoxische Aktivität der Fraktionen

Die methanolischen Extrakte der verschiedenen Pflanzenteile wurden mit Lösungsmitteln zunehmender Polarität für spätere Zytotoxizitätsstudien an den Zelllinien fraktioniert. Die hexanische Fraktion, die aus der Flüssig-Flüssig-Trennung des methanolischen Extrakts der Wurzelrinde (HFBa) gewonnen wurde, zeigte im Vergleich zum ursprünglichen Extrakt eine überlegene zytotoxische Wirkung mit einer CC50 zwischen 2 und 27 μg/mL in den verschiedenen Zelllinien (Tabelle 2). Der SI der Hexansäurefraktion verbesserte sich ebenfalls im Vergleich zum ursprünglichen Extrakt bei den untersuchten Zelllinien (SI = 5-54). Die methanolischen Fraktionen der Rinden- und Blattextrakte waren bei Konzentrationen von >200 μg/mL nicht aktiv (Daten nicht gezeigt).

Zuvor haben wir eine biologische Studie durchgeführt, um die antiproliferative Aktivität von B. macrocarpa zu bewerten, was zur Isolierung der Verbindung Bonediol führte, die eine moderate Aktivität in Krebszelllinien zeigte. In der vorliegenden Studie wurden jedoch keine zytotoxischen Wirkungen von HFBa nachgewiesen, die mit denen des ursprünglichen methanolischen Extrakts bei den untersuchten Zelllinien vergleichbar wären (Tabelle 2). Eine Erklärung für diese Ergebnisse könnte sein, dass Bonediol einen bestimmten Punkt der Zellproliferation (Zellzyklus oder DNA-Replikation) hemmt, während die im zytotoxischen Test beobachteten Wirkungen Schäden oder allgemeine Toxizität (Apoptose oder Nekrose) sind.

HFBa zeigte im Vergleich zu Bonediol bessere zytotoxische Wirkungen und war selektiver gegenüber dem Tumor als gegenüber normalen Zellen; der SI gilt als Indikator für die biologische Aktivität und steht nicht in Zusammenhang mit der Zytotoxizität, wenn der SI >10 ist. In dieser Hinsicht erfüllte nur HFBa diese Kriterien und war in der KB-Zelllinie mit einer CC50 von 2,73 μg/mL potenter; diese Zelllinie steht im Zusammenhang mit Mundkrebs und stimmt mit der Verwendung der Pflanze in der traditionellen Maya-Medizin für chronische Mundläsionen überein, ein Begriff, der mit Krebs in Verbindung gebracht werden könnte.

3.3. GC-MS-Analyse

Die Identifizierung und chemische Analyse der bioaktiven Hexanfraktion mittels GC-MS ist in Tabelle 3 dargestellt. Das Chromatogramm zeigte insgesamt acht Peaks, von denen sechs in der Datenbank identifiziert wurden: Dodecansäure, Tridecansäure, 2-Nonylmalonsäure, Dimethylester, Stigmasta-7,16-dien-3-ol, 9,19-Cyclo-lanost-24-en-3-ol und Bonediol. Letzteres wurde anhand der Retentionszeit und des Vergleichs des Massenspektrums eines zuvor aus B. macrocarpa isolierten authentischen Standards identifiziert. Die wichtigsten gefundenen Komponenten waren die folgenden: 2-Nonylmalonsäure, Dimethylester (37,39%), gefolgt von Stigmasta-7,16-dien-3-ol (13,63%), Dodecansäure (13,22%), 9,19-Cyclo-lanost-24-en-3-ol (9,90%) und Bonediol (8,98%). Nicht identifizierte Komponenten mit Retentionszeiten von 8,092 (6,22 %) und 14,207 (5,38 %) sowie n-Tridecansäure (5,25 %) waren kleinere Verbindungen im HFBa (Abbildung 1).

Abbildung 1

Gaschromatographie von HFBa.

Bonediol wurde aus dem methanolischen Extrakt von B. macrocarpa-Wurzeln als bioaktive Komponente isoliert. In dieser Arbeit haben wir das Vorhandensein dieser Verbindung in einer niedrigen Konzentration nachgewiesen, so dass sie als möglicher chemotaxonomischer Marker bezeichnet werden könnte. Darüber hinaus wurde in anderen Arten wie B. pungens ein Triterpen isoliert, und aus B. ruscifolia wurden zwei Triterpene isoliert, ohne dass über eine biologische Aktivität berichtet wurde. In dieser Arbeit haben wir nur Hinweise auf das Vorhandensein eines von Lanosterol abgeleiteten Triterpens in der aktiven Hexanfraktion gefunden. Darüber hinaus haben wir ein ubiquitiniertes Sterol, ein Derivat von Stigmasterol, nachgewiesen. Unseres Wissens ist dies das erste Mal, dass beide Verbindungen in dieser Gattung nachgewiesen wurden.

In den letzten Jahren ist nicht nur die Untersuchung von medizinisch bioaktiven Verbindungen aus Pflanzen häufiger geworden, sondern auch die der Pflanzenextrakte selbst oder der Mischung von Verbindungen, die zusammen eine bessere biologische Aktivität ergeben könnten als die einer einzelnen Verbindung. In dieser Arbeit werden die Komponenten als Fingerprinting von HFBa mittels GC-MS für zukünftige Standardisierungen beschrieben.

3.4. DNA-Fragmentierung

Wir beobachteten, dass der Methanolextrakt aus den Wurzeln von B. albiflora eine typische Morphologie der Apoptose (Daten nicht gezeigt) bei KB-Zelllinien zeigte. In ähnlicher Weise wurde gezeigt, dass HFBa bei KB-Zelllinien eine apoptotische Morphologie hervorruft. Diese Ergebnisse veranlassten uns zu untersuchen, ob die Hexanfraktion, die bei der KB-Zelllinie die größte Zytotoxizität und die morphologischen Merkmale der Apoptose aufwies, diesen Prozess auslösen könnte; daher haben wir die Fragmentierung der DNA untersucht, die typisch für den Prozess der Apoptose ist. Die DNA-Fragmentierung wurde in einem Konzentrationsbereich von 10 oder 50 μg/mL und einer Inkubationszeit von 6-24 Stunden von einem geringeren zu einem größeren Ausmaß registriert. Abbildung 2 zeigt die typische DNA-Fragmentierung in KB-Zellen nach Behandlung mit 50 μg/mL HFBa und einer Inkubationszeit von 18 Stunden. Mehrere Studien haben die apoptotische Wirkung bestimmter methanolischer Pflanzenextrakte nachgewiesen. Allerdings haben nur wenige Studien die chemischen Eigenschaften der Verbindungen untersucht, die diese Wirkung entfalten könnten. In diesen wenigen Studien wurde im Allgemeinen festgestellt, dass die organischen Fraktionen mit niedriger Polarität für die apoptotische Wirkung auf die Zelllinien verantwortlich sind, was mit den Ergebnissen dieser Studie übereinstimmt.

Abbildung 2

Wirkung des Hexan-Wurzelextrakts Bonellia macrocarpa auf die DNA-Fragmentierung in KB-Zellen. Nach der Behandlung der Zellen mit einer Konzentration von 50 μg/mL von B. macrocarpa für 12 h wurde die DNA isoliert und auf einem 1,5%igen Agarosegel aufgetrennt. Die DNA wurde mit Ethidiumbromid gefärbt und unter UV-Licht sichtbar gemacht. Lanes 1 bis 4: Lane 1 (Negativkontrolle): DNA aus unbehandelten KB-Zellen nach 18 Stunden; Spur 2 (positive Kontrolle): DNA aus KB-Zellen, die nach 18 Stunden mit 50 μg/ml Etoposid behandelt wurden; Spur 3: DNA aus KB-Zellen, die nach 18 Stunden mit 50 μg/ml Extrakt behandelt wurden; Spur 4: DNA-Molekulargewichtsmarker.

Es ist nicht bekannt, ob die Verbindungen in HFBa für die Apoptoseinduktion verantwortlich sind, aber es kann nicht auf eine einzelne Verbindung wie Bonediol zurückgeführt werden, das zwar im Extrakt vorhanden ist, aber hohe Konzentrationen benötigt, um Apoptose zu induzieren (Daten nicht gezeigt), im Gegensatz zu HFBa, das bei 10 μg/mL DNA-Fragmentierung induziert. In diesem Zusammenhang berichten wir neben Bonediol über das Vorhandensein von Dodecansäure und einem Derivat von Stigmasterol als Bestandteile von HFBa. Diese Verbindungen wurden mit der zytotoxischen Aktivität in Verbindung gebracht, die für die Hexanfraktion von Crocus sativus beobachtet wurde. Darüber hinaus haben einige Autoren nachgewiesen, dass Stigmasterol-Derivate eine signifikante zytotoxische Aktivität bei Krebszelllinien aufweisen, die von der Apoptose abhängen. Insbesondere Spinasterol (Stigmasta-7,22-dien-3beta-ol) hat nachweislich die Inzidenz von Hauttumoren in vivo verringert. Spinasterol und das in dieser Studie untersuchte Derivat unterscheiden sich durch die Doppelverknüpfung an Position 22 bei Spinasterol und Position 16 beim Stigmasterol-Derivat. Möglicherweise könnte Stigmasta-7,22-dien-3beta-ol zu der in dieser Studie beobachteten zytotoxischen Aktivität beitragen. Darüber hinaus ist bekannt, dass Lanostane eine Gruppe von tetrazyklischen Triterpenoiden sind, die sich von Lanosterin ableiten und vielfältige Aktivitäten gegen Krebszellen haben, einschließlich der Induktion der Apoptose. Möglicherweise haben die in der aktiven Hexanfraktion nachgewiesenen Verbindungen vom Lanostan- und Stigmasterol-Typ einen gewissen Grad an zytotoxischer Aktivität und eine apoptoseauslösende Wirkung. Es ist wahrscheinlich, dass mehrere in der Hexanfraktion vorhandene Verbindungen synergistisch wirken, um Zytotoxizität und Apoptose zu induzieren.

3.5. Analyse der Aktivität von Caspasen

Um herauszufinden, ob der Mechanismus der Aktivierung der DNA-Fragmentierung durch die Aktivierung der Apoptose über den intrinsischen oder den extrinsischen Weg ausgelöst wurde, haben wir die Aktivität der Caspasen bewertet, die für beide charakteristisch ist. Die Inkubationszeiten betrugen 2, 4, 6 und 12 Stunden, um ein Aktivierungsprofil zu erhalten. Caspase 8 wurde nach 6 Stunden Behandlung mit 50 μg/ml HFBa aktiviert; der Anstieg war dreimal so hoch wie bei Kontrollzellen ohne Behandlung (Negativkontrolle) (Abbildung 3). Während der Inkubationszeit von 2, 4 und 12 Stunden wurde kein Anstieg der Aktivierung von Caspase 8 beobachtet. Caspase 9 wurde in KB-Zellen nach der Behandlung mit 50 μg/mL HFBa während 2-12 Stunden nicht aktiviert, was auf eine fehlende Apoptoseaktivierung durch den intrinsischen Weg hindeutet (Abbildung 4). Die Caspase-3-Aktivität stieg in den mit HFBa behandelten Zellen im Vergleich zur Kontrollgruppe um das Vierfache an, was mit der Aktivierung von Caspase 8 übereinstimmt (Abbildung 5). Der Anstieg der Caspase 8-Aktivität ist typisch für die Aktivierung des extrinsischen Weges der Apoptose, der wiederum andere Procaspasen aktiviert, darunter auch Caspase 3, was wiederum zum Abbau von Kernproteinen wie Laminin A, Fodrin, Aktin und Gelsolin führt. Sie führt auch zur Freisetzung des Caspase-aktivierten DNase-Proteininhibitors (ICAD), der in das Enzym Caspase-aktivierte DNase (CAD) umgewandelt wird, dessen Ziel der DNA-Abbau ist, wie in Abbildung 2 dargestellt. Da Caspase 9 nicht aktiviert wurde, schließen wir, dass B. albiflora die Apoptose über den extrinsischen Weg auslöst. Dies beweist das große Potenzial, das diese Fraktion als alternative oder ergänzende Therapie bei der Behandlung von Krebs besitzt. In der Literatur finden sich mehrere Studien über Pflanzenextrakte und ihre Auswirkungen auf die Induktion des intrinsischen Apoptosewegs. Nur wenige Studien haben jedoch die Aktivierung des extrinsischen Apoptosewegs durch Pflanzenextrakte gezeigt; so induziert der methanolische Extrakt von Paeonia suffruticosa die Apoptose in der menschlichen Magenkrebs-Zelllinie (AG3), und Löwenzahnwurzel-Extrakt hat die Fähigkeit, Apoptose in der chronischen myelomonozytären Leukämie-Zelllinie (CMML) und in arzneimittelresistenten Melanomzellen zu induzieren. Es ist nicht bekannt, welche der in der aktiven Fraktion von B. albiflora enthaltenen Verbindungen die Aktivierung des extrinsischen Weges der Apoptose bewirken können. Es gibt jedoch Berichte über die Induktion von Apoptose durch die Aktivierung des extrinsischen Signalwegs, die durch natürliche und synthetische Triterpenoide vermittelt wird. Das aus Poriacocos isolierte Triterpenoid vom Lanostan-Typ, Polyporensäure C, induziert die Caspase-8-vermittelte Apoptose bei menschlichem Lungenkrebs. Insbesondere wurde gezeigt, dass β-Sitosterin (Strukturisomer von Stigmasterin) Apoptose durch Aktivierung des extrinsischen Weges auslöst, indem es die Fas-Signalisierung in menschlichen Brustkrebszellen aktiviert. Dies könnte darauf hindeuten, dass sowohl die Triterpen- als auch die Sterinkomponenten des in dieser Studie verwendeten Extrakts eine wichtige Rolle bei der Induktion der Apoptose spielen, die durch die Aktivierung des extrinsischen Wegs vermittelt wird.

Abbildung 3

Die sechsstündige Behandlung mit der Hexanfraktion von Bonellia macrocarpa induzierte die Aktivierung von Caspase 8. Die Behandlungen waren die folgenden: DMSO (0,05 %), Kontrolle (keine Behandlung), Etoposid (50 μg/mL) und HFBa (50 μg/mL). Jedes Symbol ist der Mittelwert ± SD der relativen Caspase-Aktivierung aus drei Assays, normalisiert mit der Kontrollgruppe. Einseitige ANOVA: , ; Tukey’s post-hoc Test: im Vergleich zu DMSO und Kontrollgruppe; im Vergleich zu DMSO und Kontrollgruppe; im Vergleich zu HFBa.

Abbildung 4

Die Behandlung während 12 Stunden mit der Hexanfraktion von Bonellia macrocarpa induzierte keine Caspase 9 Aktivierung. Die Behandlungen waren die folgenden: DMSO (0,05 %), Kontrolle (keine Behandlung), Etoposid (50 μg/mL) und HFBa (50 μg/mL). Jedes Symbol ist der Mittelwert ± SD der relativen Caspase-Aktivierung aus drei Assays, normalisiert mit der Kontrollgruppe. Einseitige ANOVA: , ; Tukey’s post-hoc Test: gegenüber allen Gruppen.

Abbildung 5

Behandlung während 12 Stunden mit Bonellia macrocarpa Hexanfraktion induzierte Caspase 3 Aktivierung. Die Behandlungen waren die folgenden: DMSO (0,05%), Kontrolle (keine Behandlung), Etoposid (50 μg/mL) und HFBa (50 μg/mL). Jedes Symbol ist der Mittelwert ± SD der relativen Caspase-Aktivierung aus drei Assays, normalisiert mit der Kontrollgruppe. Einseitige ANOVA: , ; Tukey’s post-hoc-Test: im Vergleich zu DMSO und Kontrollgruppe; im Vergleich zu DMSO und Kontrollgruppe.

Unseres Wissens wurde hier zum ersten Mal nachgewiesen, dass der Extrakt einer in der traditionellen Maya-Medizin verwendeten Pflanze eine Wirkung auf die Apoptose besitzt. Künftige Studien werden darauf abzielen, den Extrakt zu standardisieren und ihn mit In-vivo-Modellen zu bewerten. Weitere Studien sind notwendig, um die Verbindungen, die für die beobachtete zytotoxische Aktivität verantwortlich sind, und ihren genauen Mechanismus der Apoptose zu klären.

4. Schlussfolgerungen

Die Hexanfraktion der Wurzeln von B. albiflora übt zytotoxische Wirkungen aus und induziert die Apoptose über den extrinsischen Weg, was auf ihr Potenzial für die Behandlung von Krebs hinweist. Wir schlagen die vollständige Isolierung der in der Hexanfraktion von B. albiflora enthaltenen Komponenten vor. albiflora zur Bewertung im zytotoxischen Assay und zur Induktion von Apoptose, um zu klären, welches die aktiven Verbindungen sind, und um den Wirkmechanismus zu verstehen.

Interessenkonflikte

Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte und keine finanziellen Verbindungen zu den in der Arbeit erwähnten kommerziellen Unternehmen haben.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von SEP-CONACYTCB-2010-156755 unterstützt. Die Autoren bedanken sich bei L. Torres-Tapia von der Abteilung für Biotechnologie des Wissenschaftlichen Forschungszentrums von Yucatan (CICY) für die technische Unterstützung bei der GC-MS-Analyse. Die Autoren sind außerdem Dr. Glenn Jackson für die Überprüfung der Arbeit in englischer Sprache dankbar.