Materialien und Methoden

Probenerhebung

Teilnehmer ab 18 Jahren wurden über E-Mail-Benachrichtigungen und Anzeigen an den Schwarzen Brettern der University of British Columbia, Vancouver BC, zur Teilnahme an der Studie eingeladen. Die Teilnehmer wurden gebeten, Proben mit trockenen, geflockten Wangenabstrichen (Puritan PurFlock, Fisher Scientific, Waltham MA) und Wangenabstrichen mit Schwammspitze (Oragene ORAcollect, DNA Genotek, Ottawa, ON) unter Anleitung abzugeben; die Reihenfolge, in der diese Proben abgegeben wurden, wurde per Computer randomisiert. Ein Forschungsassistent war während der Probenentnahme anwesend, um Fragen der Teilnehmer bezüglich der Anweisungen zur Probenentnahme zu beantworten. Alle Proben wurden bei Raumtemperatur gelagert. Pharmakogenetische Berichte wurden den Teilnehmern nicht ausgehändigt, da dies nicht in den Rahmen dieser Studie fiel.

DNA-Extraktion

DNA wurde mit dem Ambion MagMAX Bead-basierten DNA-Extraktionskit (Applied Biosystems, Foster City, CA) gemäß den Anweisungen des Herstellers extrahiert. Die DNA wurde 3 Tage nach der Probenentnahme extrahiert und in 60 µl eluiert. Die DNA-Quantität und -Qualität wurde mit dem Qubit 2.0-Fluoreszenz-Assay (ThermoFisher Scientific, Waltham MA) bewertet. Die Reinheit der Proben wurde anhand der Werte für die optische Dichte A260/280 (ODA260/280) mit dem NanoVue-Spektralphotometer bestimmt.

Genotypisierung

Die Genotypisierung wurde auf dem quantitativen Polymerase-Kettenreaktions (qPCR)-Instrument QuantStudio 12K Flex (LifeTechnologies, Carlsbad, CA) mit vom Hersteller (ThermoFisher Scientific, Waltham MA) validierten Assays durchgeführt. Der Inhalt der Assays umfasste 28 SNPs, die das Ansprechen auf Arzneimittel auf der OpenArray-Plattform beeinflussen (siehe Zusatzdatei 2), und einen CYP2D6 CNV TaqMan-Assay (Assay ID: Hs_00010001_cn). Zur Validierung der Assays wurden 44 DNA-Kontrollen aus dem National Institute of General Medical Sciences (NIGMS), Human Genetic Cell Repository am Coriell Institute for Medical Research genotypisiert. Die Konkordanz der Calls wurde mit dem erwarteten Genotyp bestätigt. Darüber hinaus wurden die Ergebnisse durch Sanger-Sequenzierung der Kontroll-DNA verifiziert. Für jeden Lauf wurden die Proben der Teilnehmer in doppelter Ausführung auf dem OpenArray und in vierfacher Ausführung auf dem CNV-Assay zusammen mit Corriell-DNA-Proben als Positivkontrollen und Kontrollen ohne Vorlage (NTCs) durchgeführt.

Statistische Analyse

Die TaqMan Genotyper Software v1.3.1 (Applied Biosystems) wurde zur Bestimmung der SNP-Genotypisierungs-Call-Raten auf dem OpenArray verwendet. Die Genotypisierungsrate wurde für jeden OpenArray-Assay berechnet, indem die Gesamtzahl der erfolgreich zugewiesenen Genotypen durch die Gesamtzahl der versuchten Genotypisierungen geteilt wurde.

Für den CNV-TaqMan-Assay wurde die Software CopyCaller v2.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA) verwendet, um CYP2D6-Kopienzahl-Calls und CNV-Konfidenzwerte zuzuweisen. Den DNA-Proben wurde eine diploide Wildtyp-Kopienzahl zugeordnet, und Kopienzahlvariationen (Deletions- oder Duplikationsereignisse) wurden in die 2N- bzw. CNV-Gruppen eingeteilt. Für die SNP- und CNV-Genotypisierungsergebnisse wurde eine 95%ige Genotypisierungsrate und ein 95%iger Konfidenzwert festgelegt. Um den signifikanten Unterschied zwischen der DNA-Ausbeute, der Reinheit und den Call-Raten der verschiedenen DNA-Typen in Paaren zu ermitteln, wurde ein Student’s t-Test mit zwei Stichproben unter der Annahme ungleicher Varianzen berechnet. Zur Berechnung der Konkordanz wurden die Genotypisierungszuordnungen verglichen, die aus den DNA-Proben desselben Teilnehmers generiert wurden (Schwammabstriche vs. trockengeflockte Abstriche).

Ergebnisse

Einunddreißig Teilnehmer wurden rekrutiert und sammelten Schwammabstriche und trockengeflockte Abstriche. Die Teilnehmer empfanden die Anleitung zur Entnahme von Abstrichen für beide Arten von Abstrichen als einfach und leicht zu befolgen. Die Teilnehmer stellten Fragen zum erforderlichen Druck beim Reiben der Tupfer und zur richtigen Platzierung der Tupfer im Mund. Die Kommentare der Teilnehmer zu den beiden Abstrichtupfern waren ähnlich, wobei einige die Abstrichtupfer mit Schwammspitze und andere die Abstrichtupfer mit Trockenflockung bevorzugten; es gab keine einheitliche Meinung.

Es gab einen signifikanten Unterschied in der durchschnittlichen DNA-Ausbeute zwischen der DNA, die mit Abstrichtupfern mit Trockenflockung gesammelt wurde, und den Abstrichtupfern mit Schwammspitze (0,26 ± 0,34 µg vs. 1,91 ± 1,44 µg p = 4,4 × 10-7; Tabelle 1). Die durchschnittliche DNA-Reinheit lag bei allen Entnahmetypen im akzeptierten Bereich für reine DNA (Mittelwert (SD)) von 1,72(0,78) und 1,85(0,39) für trockene Abstriche bzw. Abstriche mit Schwammspitze.

Es gab drei Proben aus Schwammtupfern, die niedrige DNA-Konzentrationen (< 5 ng/µl) aufwiesen. Diese drei Proben hatten 100 % Genotypisierungs-Call-Raten auf dem OpenArray und 100 % CNV-Konfidenzwerte (Abb. 1). Umgekehrt wies eine der Proben mit einer DNA-Konzentration von 79 ng/µl die niedrigste OpenArray-Call-Rate auf (18 %). Die höchsten Call-Raten auf dem OpenArray (> 95%) für trocken geflockte Abstriche wurden bei sieben Proben mit Konzentrationen zwischen 1,2 und 8,9 ng/µl beobachtet (Abb. 1a). Die höchsten CNV-Vertrauenswerte (> 95%) wurden für Proben mit einer Konzentration zwischen 1,0 und 24,4 ng/µl (Abb. 1b) ermittelt.

Für alle Assays auf dem OpenArray, Bei allen Assays auf dem OpenArray führten DNA-Proben aus Abstrichen mit Schwammspitze zu einer insgesamt höheren Genotypisierungsrate (97 %) im Vergleich zu trockenen Abstrichen (54 %) (Abb. 2). Mit einem zusätzlichen Schritt einer 0,5-fachen Verdünnung der extrahierten DNA wiesen die Abstriche mit Schwammspitze eine konsistente Genotypisierungs-Call-Rate > von 95 % auf. Die Proben-Call-Rate auf dem OpenArray variierte je nach Person, wobei 29 (93,5 %) Teilnehmer eine Proben-Call-Rate von > 95 % bei DNA aus Schwammabstrichen und 4 (12,9 %) eine Proben-Call-Rate von > 95 % bei DNA aus trockenen Abstrichen aufwiesen. Eine 94%ige Übereinstimmung der erfolgreich durchgeführten Genotypisierungen wurde zwischen Abstrichen mit Schwamm und trockenen Abstrichen von derselben Person festgestellt.

Kopienzahl-Calls für CYP2D6 wurden 2 (6,5 %) der Proben aus Schwammtupfern mit einem Gesamtkonfidenzniveau von 0,99 zugeordnet. Im Vergleich dazu wurden bei 8 (25,8 %) der Proben aus trockenen Abstrichen Kopienzahl-Calls mit einer Gesamtkonfidenz von 0,91 ermittelt (siehe Additional file 3).

Diskussion

Der Zweck dieser Forschung besteht darin, Forschern und Unternehmen dabei zu helfen, eine optimale Entnahmemethode zu finden, die qualitativ hochwertige DNA für die Genotypisierung liefert. Diese Studie liefert neue Informationen über die DNA-Qualität für zwei Arten von Abstrichen, die hoch war (definiert als ODA260/A280 1,8), obwohl es einen signifikanten Unterschied in der DNA-Ausbeute gab (p-Wert = 4,4-7). Auf der OpenArray-Plattform wiesen Abstriche mit Schwammspitze die höchste Gesamt-Genotypisierungsrate (97 % vs. 54 %) und den höchsten Konfidenzwert für den CYP2D6 CNV TaqMan Assay (0,99 vs. 0,91) auf. Eine > 95%ige SNP-Genotypisierungs-Call-Rate gilt als Ausdruck einer akzeptablen Datenqualität und ein CNV-Konfidenzwert von 99% als hohe Qualität.

Eine aus dem Schwammtupfer isolierte DNA-Probe wies eine Call-Rate von unter 95% auf. In der routinemäßigen Laborpraxis würden Proben mit niedrigen Abrufraten aufgrund unvollständiger Ergebnisse für Patientenberichte wieder eingesammelt werden. Durch das Weglassen dieser Probe erhöhte sich die Gesamt-Genotypisierungsrate auf 99,5 % für die Abstriche mit der Schwammspitze.

CYP2D6 CNV-Ergebnisse zeigten einen Anstieg der CNV-Zuordnungen für DNA aus trockenen Abstrichen 8(25,8 %) im Vergleich zu Abstrichen mit der Schwammspitze 2(6,5 %). Eine höhere Anzahl von CNV-Zuordnungen korrelierte mit niedrigeren Vertrauenswerten. Die Mehrheit der Teilnehmer, 30 (97 %), konnte Proben sammeln, die eine hohe Genotypisierungsrate für den Schwammtupfer ergaben, während nur wenige Personen, 4 (13 %), in der Lage waren, Proben mit hoher Call-Rate für beide Arten von Abstrichen zu sammeln. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Abstriche mit der Schwammspitze für die Patienten akzeptabel waren und eine gute DNA-Qualität mit ausreichender Ausbeute für pharmakogenetische Tests mittels qPCR lieferten.