STRUKTURELLE GRUNDLAGEN DER WIRKUNG

Die 16S rRNA von Escherichia coli ist eine der am besten untersuchten rRNA-Untereinheiten, und insbesondere die Wechselwirkungen verschiedener Aminoglykosid-Antibiotika mit der 16S rRNA und ihre Auswirkungen auf den Prozess der Übersetzung von mRNA in Polypeptide wurden untersucht (35). Ähnliche rRNA-Strukturen gibt es auch in anderen Organismen, wie Hefe und Tetrahymena (33). Die Behandlung der rRNA mit einem Aminoglykosid schützt mehrere Nukleinbasen in der rRNA vor chemischen Veränderungen, was bedeutet, dass diese Moleküle eine hohe Affinität für bestimmte Stellen in der rRNA besitzen. Diese Art der Bindung wurde von Noller (35) mit der von Enzyminhibitoren verglichen, die normalerweise an die aktiven Stellen von Enzymen binden und deren Aktivitäten beeinträchtigen. Verschiedene Klassen von Aminoglykosid-Antibiotika binden an unterschiedliche Stellen der rRNA, je nach struktureller Komplementarität der beiden. So wird angenommen, dass Neomycin, Paromomycin (Abb. 1), Gentamicin und Kanamycin in ähnlicher Weise an die A-Stelle der 16S rRNA in E. coli binden und dass sie die Basen A1408 und G1494 in chemischen Footprinting-Experimenten schützen (Abb. 2) (33). Vier Basen, A1408, A1492, A1493 und G1494, in der A-Seite der rRNA interagieren mit der tRNA, wenn auch mit unterschiedlicher Affinität. Die Bindung der genannten Aminoglykoside an die A-Site in der Dekodierungsregion (d. h. die Stelle, an der Codon und Anticodon erkannt werden) beeinträchtigt die genaue Erkennung der kognitiven tRNA durch die rRNA während der Translation (35). Es wird angenommen, dass diese Wechselwirkungen auch die Translokation der tRNA von der A-Site zur Peptidyl-tRNA-Site (P-Site) beeinträchtigen.

Puglisi und Mitarbeiter (12-14, 39) haben kürzlich strukturelle Beweise für die Art und Weise der Wechselwirkungen von Paromomycin, einem repräsentativen Aminoglykosid der Neomycin-Klasse, mit einer 27-Nukleotid-RNA-Vorlage geliefert, die so gestaltet war, dass sie die A-Site-Region der 16S rRNA in E. coli nachahmt (Abb. 3A). Das Design der RNA-Vorlage basierte auf dem bisherigen Wissen, dass Paromomycin mit dem Basenpaar C1407 – G1494, A1408, A1493 und U1495 interagiert und dass diese Basen für eine hochaffine Bindung absolut notwendig sind (39) (in Abb. 3A grau dargestellt). Weitere strukturelle Merkmale, wie die Tasche, die durch die Asymmetrie in der internen Schleifenregion aufgrund des Vorhandenseins von A1492 und der Basenpaarung C1409 – G1491 in der unteren Stammregion entsteht, sind ebenfalls wichtig. Diese strukturellen Merkmale bilden zusammen eine Tasche, die für die Bindung von Paromomycin optimal ist (siehe unten).

In dem nativen A-site-RNA-Template hat der Stamm Basenpaarungswechselwirkungen bei U1406 – U1495 (nicht kanonisch) und C1407 – G1494 (Abb. 3A). Nach der Bindung von Paromomycin wird die von A1408, A1492 und A1493 gebildete Struktur stabilisiert (Abb. 2B), und die Basen A1408 und A1493 bilden ein nicht-kanonisches Basenpaar (12, 39). Das Nukleotid A1492, das keine Basenpaar-Wechselwirkungen aufweist, erzeugt einen Knick in der RNA-Struktur, und die kombinierten Effekte von A1492 und dem Basenpaar A1408 – A1493 erzeugen eine Ausbuchtung in der A-Stelle, an die Paromomycin bindet und den Winkel des Knicks weiter vergrößert (Abb. 2B). Die funktionellen Gruppen von Paromomycin, wie die Hydroxyl- und Aminogruppen, nehmen an spezifischen Wechselwirkungen mit dem RNA-Molekül teil (siehe unten).

Die durch A1492 und das Basenpaar A1408 – A1493 gebildete Tasche wird von Ring II von Paromomycin besetzt, und dieser Ring stapelt sich über der Base G1491 (in Abb. 2B durch einen gelben Pfeil dargestellt) (12). Ring I von Paromomycin stellt spezifische Kontakte mit den „universell“ konservierten Basenpaaren U1406 – U1495 und C1407 – G1494 in der rRNA her. Es ist bemerkenswert, dass Ring I für die spezifische Bindung von Aminoglycosid-Antibiotika an rRNA absolut notwendig ist. Die Ringe III und IV von Paromomycin verlängern diese Wechselwirkungen weiter in die Hauptfurche der rRNA. Die Amino- und Hydroxylgruppen tragen hauptsächlich zu den unspezifischen Wechselwirkungen von Paromomycin mit rRNA bei; es handelt sich also nicht um sequenzabhängige Wechselwirkungen. Ein weiterer wichtiger Punkt ist, dass das Basenpaar C1409 – G1491 den Sitz für die Bindung des Aminoglykosids in der Tasche bildet, und ein falsches Basenpaar in dieser Position führt zum Verlust der Bindung (12). Im Allgemeinen binden Aminoglykoside, die strukturelle Merkmale mit Paromomycin teilen, auf ähnliche Weise an rRNA (13). Allerdings scheinen verschiedene Aminoglykosid-Antibiotika in mehr als einer Konformation an dieselbe Bindungsstelle zu binden (28). Im Wesentlichen muss die Konformation des Aminoglykosids, die an RNA bindet, den elektronischen und sterischen Beschränkungen der Bindungsstelle genügen. In einer anderen Studie über den Komplex aus Gentamicin Cla und der A-site-RNA-Vorlage zeigten die Ringe I und II von Gentamicin Cla (die denen von Paromomycin ähneln) ähnliche Bindungswechselwirkungen wie im Komplex aus Paromomycin und der A-site-RNA-Vorlage (57). Allerdings interagiert Ring III in Gentamicin Cla mit den Basenpaaren U1406 – U1495 und G1405 – C1496 in der oberen Stammregion (Abb. 3A). Aufgrund dieser Beobachtungen schlugen Puglisi und Mitarbeiter (57) vor, dass alle Aminoglykoside, die auf die A-Site der 16S rRNA abzielen, auf eine gemeinsame Weise binden, ähnlich wie die Ringe I und II in Paromomycin und Gentamicin.

Obwohl die Gesamtstruktur der rRNA bei allen Spezies im evolutionären Sinne konserviert ist, gibt es Unterschiede, die die Bindung von Aminoglykosiden an die rRNA von Prokaryonten spezifischer machen – mit einer mindestens 10-fach höheren Affinität als an die von Eukaryonten (19, 35, 38). Dies ist kein großer Unterschied in der Bindungsaffinität und könnte zum Teil die toxischen Wirkungen dieser Antibiotika in Säugetiersystemen erklären. Eukaryotische rRNA enthält ein Guanin anstelle von A1408, was zu einem Basenpaar G1408 – A1493 führt. Außerdem gibt es das passende Basenpaar C1409 – G1491 in Eukaryonten nicht. Diese Unterschiede führen insgesamt zu einer geringeren Affinität von Aminoglykosiden für die eukaryotische rRNA (12, 19, 35, 38). Nach diesen Unterschieden verändert die Bindung von Aminoglykosiden an die A-Stelle der rRNA in Prokaryonten die Konformation der A-Stelle und beeinträchtigt die spezifischen Interaktionen von mRNA und tRNA an dieser Stelle, was zu unregelmäßigen Codon-Anticodon-Interaktionen führt. Bisher gibt es nur wenige strukturelle Informationen über die Besonderheiten dieser Interaktionen auf ribosomaler Ebene (siehe unten), aber die eindeutige und ultimative Folge ist eine Störung des Translationsprozesses.

Eine weitere Strukturstudie wurde zur Bindung von Tobramycin (Abb. 1) an ein RNA-Aptamer durchgeführt (23). Das RNA-Aptamer, das in dieser Studie verwendet wurde, war eine 26-Nukleotid-Stammschleifen-RNA (Abb. 3B). In diesem RNA-Aptamer gibt es vier Mismatch-Paare, U7 – G20, G8 – U19, G9 – A18 und U11 – U16, die Teil der Haarnadelschleife mit Reißverschluss sind. Tobramycin bindet in dieser Rille, die teilweise von der Oberfläche der tiefen Rille und der Guaninbase des Rests G15 eingekapselt ist (Abb. 4). In diesem Komplex sitzt der Ring I des Tobramycins auf dem Boden der tiefen Furche. Eine der Aminogruppen an Ring II des Tobramycins interagiert mit dem Phosphatgerüst in der tiefen Furche, und die andere Aminogruppe ist dem Lösungsmittel ausgesetzt. Ring III befindet sich in der Mitte der tiefen Furche, wobei die Hydroxylgruppen zum Boden der Furche gerichtet sind. Die oben beschriebene Konformation des RNA-Aptamers ähnelt derjenigen der Haarnadelschleifen in tRNA und rRNA (23).

Die 7,5 Å auflösende Röntgenstruktur des funktionellen Komplexes vonT. thermophilus 70S rRNA, der tRNA und mRNA enthält, ist hilfreich, um die obige Diskussion in die richtige Perspektive zu rücken (5). Anhand dieser Struktur kann man sich vorstellen, wie gut die Modellstudien mit kleineren RNA-Vorlagen wie dem Tobramycin-RNA-Aptamer und der A-site-RNA mit Paromomycin (siehe oben) in die vollständige Struktur der rRNA passen würden. Die A-Site in der 16S rRNA-Untereinheit der 70S rRNA ist in der Nähe der Schnittstelle von tRNA und der 50S rRNA-Untereinheit zu sehen, in der Nähe des Codon-Anticodon-Paares (Abb. 2A). Beim Vergleich der Lösungsstruktur der A-site-RNA-Vorlage mit der A-site in der Röntgenstruktur der 70S rRNA zeigte sich, dass die Röntgenstruktur eng mit der Paromomycin-gebundenen RNA-Vorlage verwandt ist, nicht aber mit der nativen Lösungsstruktur der A-site-RNA-Vorlage (5). Dies ist faszinierend und deutet darauf hin, dass die Ausbuchtung oder der Knick in der Nähe der Basen A1492 und A1493 in der 70S-rRNA in der funktionellen Form vielleicht immer vorhanden ist. Wenn dies der Fall wäre, würde dies bedeuten, dass die Bindungstasche für Paromomycin bereits vorhanden ist, wenn die 70S rRNA funktionsfähig wird; daher ist sie für eine Hemmung durch Paromomycin prädisponiert. Dies steht im Widerspruch zu der Behauptung, dass die Bindung von Paromomycin den Knickwinkel an der Bindungsstelle vergrößert. Diese Idee wird durch eine neuere Studie untermauert, die darauf hindeutet, dass die Affinitäten verschiedener Aminoglykoside für die A-Site-RNA-Matrize unterschiedlich sind, und dass die Fähigkeit dieser Antibiotika, die Proteinsynthese in vitro zu hemmen, ebenfalls variiert (15). Gentamicin und mehrere andere verwandte Antibiotika interagieren mit der A-site-RNA mit Dissoziationskonstanten (Kd) im mikromolaren Bereich, aber sie hemmten einen in vitro-Translationsprozess mit 50 % hemmender Konzentration im nanomolaren Bereich (15). Der letztgenannte Befund wurde auf die Bindung des Aminoglykosids an die intakte rRNA in der Dekodierungsregion (A-site) zurückgeführt, und der Unterschied in der Bindung an die intakte rRNA im Vergleich zur Bindung an die A-site-Template-RNA könnte auf die Unterschiede in den Konformationen dieser beiden RNAs zurückzuführen sein, wie oben erörtert.

Die A-site stellt schwache Kontakte mit der mRNA und der tRNA her, was darauf hindeutet, dass diese Region eine Rolle bei der Erkennung der geeigneten tRNA über subtile Veränderungen der freien Energie spielt (5). Die Bindung von Aminoglykosid in der Nähe dieser Stelle könnte den heiklen Prozess der Wechselwirkungen zwischen Codon und Anticodon beeinträchtigen. Es wurde auch vorgeschlagen, dass die Anwesenheit eines Aminoglykosids den Komplex aus mRNA und tRNA an der A-Stelle stabilisiert, was wiederum den Prozess der Translation beeinflusst (5). Es ist schwierig, alle Wirkungen von Aminoglykosiden auf die rRNA-Struktur zu erahnen, und weitere Strukturstudien mit an die Komplexe gebundenen Aminoglykosiden, wie z. B. die 70S rRNA, werden hilfreich sein, um die subtilen Veränderungen, die zu den antibiotischen Wirkungen von Aminoglykosiden führen, aufzuklären und zu verstehen.

In einer Reihe von Untersuchungen wurden synthetische Sonden verwendet, um die Wechselwirkungen zwischen RNA-Vorlagen und Aminoglykosiden zu verstehen. Es wurde vermutet, dass Aminoglykoside an mehr als eine Zielstelle im Ribozym binden (6, 30). Kürzlich wurden mehrere Aminoglykosid-Antibiotika wie Neomycin B, Tobramycin und Kanamycin A mit Hilfe eines „Tether“ entweder symmetrisch oder asymmetrisch dimerisiert, und ihre Bindungsaffinitäten wurden mit denen der monomeren Stamm-Aminoglykoside verglichen (30). Es wurde vermutet, dass die dimerisierten Aminoglykoside bei Vorhandensein mehrerer Bindungsstellen auf der RNA mit einer höheren Affinität binden sollten als das Ausgangsantibiotikum, vorausgesetzt, dass mehrere Bindungsstellen zugänglich sind. Tatsächlich wurde beobachtet, dass die dimerisierten Aminoglykoside 20- bis 1.200-mal besser an das Tetrahymena-Ribozym binden als die Stamm-Aminoglykoside. Eine Erklärung für die höhere Bindungsaffinität könnte die erhöhte Anzahl positiv geladener Aminoglykosid-Aminogruppen sein, aber dieser Effekt scheint synergetisch mit dem entropischen Vorteil der Dimerisierung zu sein (30). Dies deutet auch auf das Vorhandensein mehrerer hochaffiner Bindungsstellen für Aminoglykosid-Antibiotika in einem RNA-Molekül hin. In einer anderen Studie wurde versucht, die RNA-Bindungseigenschaften von Paromomycin und das interkalierende Verhalten bestimmter Verbindungen wie Pyren und Thiazolorange auszunutzen (48). Diese Strategie sah Aminoglykoside als Mittel für die Zuführung von Interkalationsmitteln zur RNA vor. Das Konjugat von Paromomycin mit Thiazolorange oder Pyren zeigte bessere Bindungseigenschaften an die 27-Nukleotid-A-Site-RNA-Vorlage. Tatsächlich wurde die Dissoziationskonstante für das Paromomycin-Thiazolorange-Konjugat mit 46 nM gemessen, was als die höchste Affinität angegeben wurde, die die rRNA-A-Stelle für irgendeinen Liganden gezeigt hat.

Die strukturellen Voraussetzungen für die RNA-Bindung durch Aminoglykoside deuteten darauf hin, dass eine Ausbuchtung in der RNA-Sequenz notwendig ist, um die Bindung von Aminoglykosiden zu ermöglichen (7). Unter Verwendung eines spezifischen Stammschleifen-Derivats des RNA-Aptamers wurde eine Reihe von Studien zur chemischen Interferenz, chemischen Modifikation und Mutation durchgeführt, um die strukturellen Voraussetzungen für die Bindung von Tobramycin an das RNA-Aptamer zu verstehen. Dieses Aminoglykosid scheint hauptsächlich mit den Nukleinbasen im RNA-Aptamer zu interagieren, nicht aber mit dem Phosphatgerüst. Es wurde jedoch angenommen, dass das Vorhandensein einer Ausbuchtung für die hochaffine Bindung von Tobramycin in einem stöchiometrischen Verhältnis wichtig ist, und es wurde gefolgert, dass eine Ausbuchtung einen Hohlraum für die Wechselwirkungen zwischen dem Aminoglykosid und der Nukleinbase schafft (7). Diese Analogie lässt sich auch auf andere RNA-Stellen wie die Hammerkopfregion und die A-Stelle anwenden, wo aufgrund der nicht-kanonischen Basenpaarung oder Schleifen bzw. Ausbuchtungen ein Hohlraum vorhanden ist, der eine geeignete Stelle für die Wechselwirkung der Aminoglykoside mit den anionischen Phosphatgruppen und den Nukleinbasen bildet. In diesem Sinne schlugen Westhoff und Kollegen (49) vor, dass die Wechselwirkung von Aminoglykosiden mit RNA wahrscheinlich eher form- als sequenzspezifisch ist.

In Übereinstimmung mit diesem Konzept wurden die elektrostatischen Felder in den RNA-Falten als die leitende Kraft für die Bindung angesehen (siehe unten). Hermann und Westhoff (20) konnten die Docking-Bestätigungen mehrerer Aminoglykosid-Antibiotika in verschiedenen RNA-Templates, wie Tobramycin-RNA-Aptameren und der A-site-Region in der 16S-RNA, für die Strukturinformationen vorlagen, identifizieren. Auf der Grundlage dieser Beobachtungen wurde der Bindungsmodus von Aminoglykosiden an die trans-aktivierende Response-Element-Region in HIV vorhergesagt (20). In einer weiteren Studie über das RRE in HIV, die Bindungsregion für das Rev-Protein, untersuchten Cho und Rando (8) die Rolle einer Ein-Basen-Ausbuchtung und eines Hohlraums für die Bindung von Aminoglykosiden. In Übereinstimmung mit früheren Hypothesen wurde gefolgert, dass Furchen in den Nicht-Duplex-Regionen der RNA für die hochaffine Bindung von Aminoglykosiden an RNA wichtig sind. In diesem Fall hatte die Ausbuchtung einer einzelnen Base keinen Einfluss auf die Bindung, aber der Hohlraum, eine G-reiche Region, die aus zwei nicht-kanonischen Basenpaaren und einem einzelnen ausgebuchteten U besteht, hat eine hohe Affinität für Aminoglykoside. Die Manipulation der Kavität verringerte die Affinität der RRE-RNA für Aminoglykoside, was darauf hindeutet, dass die nicht-kanonischen Basenpaare mit den Ausbuchtungen die primären Aminoglykosid-Bindungsstellen in dieser RNA-Vorlage sind (8).