Splicing, Capping und Polyadenylierung sind drei wichtige Schritte bei der Verarbeitung von pre-messenger RNA (pre-mRNA) zu mRNA. Die Polyadenylierung (Poly(A)) beinhaltet die endonukleolytische Spaltung der prä-mRNA und das Anhängen des Poly(A)-Schwanzes an die Spaltstelle. Eine einzelne prä-mRNA enthält in der Regel einige wenige Spaltungs-/Polyadenylierungsstellen (polyA-Stellen oder pA). Die alternative Polyadenylierung (APA) kann schließlich mehrere mRNA-Polyadenylierungs-Isoformen hervorbringen.

Nach heutigem Verständnis ist die APA ein umfassender Prozess, der durch koordinierte Aktionen mehrerer kleiner Moleküle erreicht wird. Die 3′-verarbeitenden Faktoren sind die Hauptziele der APA-Regulierung. Der typische APA-Prozess umfasst die folgenden Schritte: (1) CFIm (Cleavage Factor I) bindet an das UGUA-Feld der prä-mRNA stromaufwärts der pA-Stelle und zieht CPSF (Cleavage and Polyadenylation Specificity Factor) und CSTF (Cleavage Stimulation Factor) an, um sich am Ende der RNA-Polymerase II zu versammeln; (2) während die RNA-Polymerase II voranschreitet, bindet CPSF an die pA-Signalsequenz (z. B. AAUAAA) und CSTF wird auf den neuen mRNA-Vorläufer übertragen und bindet an die GU- oder U-reiche Sequenz; (3) CPSF und CSTF initiieren die Spaltung von ~ 35 Nukleosiden nach der pA-Signalsequenz, und das Polyadenylierungsbindungsprotein (PABPN1) im Zellkern bindet an die Polyadenylierungsschwanzsequenz, um den PAP-Prozess zu starten; (4) während die PAP-vermittelte Polyadenylierung fortgesetzt wird, werden Adenosinschwänze von ~ 50-250 Nukleotiden (nt) vorbereitet (je nach Art des Organismus) und CPSF dissoziiert von seiner Bindungssequenz; (5) PABPN1 fungiert während dieser APA-Progression als molekularer Herrscher, der festlegt, wann der Polyadenylierungsprozess gestoppt werden sollte; (6) PAP beginnt zu dissoziieren, obwohl PABPN1 seinen Bindungsstatus weiterhin aufrechterhält. Die Kombination der oben genannten 6 Schritte in Verbindung mit dem 5′-Capping-Prozess fördert die Reifung der mRNA und den letztendlichen Export aus dem Zellkern in das Zytoplasma.

Ungefähr 50 ~ 80% der prä-mRNA-Transkripte von Säugetieren haben mehr als eine pA-Stelle. Die 3′-UTR der mRNA beherbergt wichtige RNA-Regulationselemente, die bestimmen, wann, wo und wie viel mRNA-Transkript übersetzt wird. APA ist ein entscheidender posttranskriptionaler 3′-UTR-Regulationsmechanismus. Die 3′-UTR-APA-Isoformen spielen verschiedene Rollen bei der Bestimmung der mRNA-Stabilität, -Lokalisierung, -Halbwertszeit und -Funktionen. Darüber hinaus haben frühere Studien gezeigt, dass APA am Fortschreiten der Krankheit und an der Empfindlichkeit gegenüber Medikamenten beteiligt ist, insbesondere gegenüber Medikamenten, die auf Chromatinmodifikatoren abzielen. Obwohl sich die APA-Forschung noch in einem frühen Stadium befindet, ist sie aufgrund ihrer einzigartigen posttranskriptionellen regulatorischen Wirkung ein potenzieller Biomarker für die Krebsprognose und -diagnose sowie ein Ziel für die Entwicklung neuer zielgerichteter Therapien.

Wie APA die prä-mRNA moduliert

Auf der Grundlage der Lokalisierung von pAs können APA in zwei Hauptkategorien eingeteilt werden: UTR-APA (Abb. 1a) und Kodierungsbereich-APA (CR-APA) (Abb. 1b-d). Bei CR-APA befinden sich die alternativen pAs in Exons oder Introns. Daher wirkt sich CR-APA über alternatives Spleißen (AS) auf kodierende Regionen aus, was zur Bildung von Protein-Isoformen mit unterschiedlichen C-Termini führt. Bei UTR-APA befinden sich die alternativen pAs im 3′-UTR, was dazu führt, dass die Transkriptionsprodukte denselben kodierenden Rahmen, aber variable 3′-UTRs enthalten. Frühere Studien deuten darauf hin, dass globale UTR-APA-Ereignisse gewebespezifisch sind, wobei die 3′-UTR-Verkürzung positiv mit der Zellproliferation und negativ mit der zellulären Differenzierung korreliert.

Der prä-mRNA 3′-Verarbeitungskomplex wird durch mehrere Elemente gebildet, darunter die kanonische Poly(A)-Signalsequenz AAUAAA oder ihre engen Varianten (z.z. B. AAAUAA, AUAAAA, AUUAAA, AUAAAU, AUAAAG, CAAUAA, UAAUAA, AUAAAC, AAAAUA, AAAAAA, AAAAAG), die mit unterschiedlicher Häufigkeit im gesamten Genom verwendet werden, in der Regel innerhalb von 15-50 nts von der pA-Stelle. UGUA-Elemente befinden sich häufig stromaufwärts der pA-Stelle, U-reiche Elemente befinden sich in der Nähe der pA-Stelle, und U/GU-reiche Elemente befinden sich innerhalb von ~ 100 nts stromabwärts der pA-Stelle. Allerdings sind ~ 20% der menschlichen Poly(A)-Signale nicht von U-/GU-reichen Regionen umgeben.

Von den 80 Kernfaktoren in Säugetierzellen sind etwa 20 an der C/P-Maschinerie beteiligt. Im Allgemeinen können diese Kernfaktoren in vier Elemente unterteilt werden (Abb. 2):

CPSF (Spaltungs- und Polyadenylierungsspezifitätsfaktor) besteht aus CPSF1-CPSF4 (auch bekannt als CPSF160, CPSF100, CPSF73 und CPSF30), WDR33 und FIP1L1 (auch bekannt als Fip1) . Nach dem derzeitigen Kenntnisstand interagieren WDR33 und CPSF4 direkt mit pAs, und CPSF3 führt die endonukleolytische Spaltung durch. Als Komplex erkennt CPSF die Polyadenylierungssignalsequenz AAUAAA und spaltet die prä-mRNA. Dadurch wird eine Sequenzspezifität erreicht, die eine wichtige Rolle bei der Regulierung der Auswahl der pA-Stelle, der Genexpression, der Migration von Krebszellen, der Metastasierung und schließlich des Krankheitsverlaufs spielen kann. Als Teil des CPSF-Komplexes ist CPSF73 eine Endonuklease, die die prä-mRNA an der pA-Stelle spaltet. Unter oxidativem Stress verlagert sich CPSF73 jedoch aus dem Zellkern in das Zytosol und bewirkt eine erhebliche Hemmung der Polyadenylierungsaktivität bei Prostatakrebs. Darüber hinaus dient Fip1, ein Mitglied des CPSF-Komplexes, möglicherweise als Regulator der zellulären Selbsterneuerung. In der Tat führt die Deletion von Fip1 in embryonalen Stammzellen (ESCs) der Maus zum Verlust des undifferenzierten Zustands der Zellen und der Fähigkeit zur Selbsterneuerung aufgrund der Verwendung der bevorzugten distalen Poly(A)-Stelle (dpA), was letztlich zu einer 3′-UTR-Verlängerung ausgewählter Gene führt, die das Zellschicksal bestimmen .

CSTF (cleavage stimulation factor) besteht aus CSTF1, CSTF2 und CSTF3 (50 kDa, 64 kDa bzw. 77 kDa) und spielt eine Schlüsselrolle bei der Spaltungsreaktion. Der CSTF-Komplex kann an das U- oder GU-reiche Feld stromabwärts der Spaltstelle binden, um die Spaltung zu beschleunigen. So interagiert beispielsweise CSTF2, auch bekannt als CSTF64, direkt mit der U/GU-reichen Region, um die Effizienz der 3′-terminalen Verarbeitung zu beeinflussen. Einige Studien berichteten, dass CSTF nicht nur die Verwendung von pAs fördert, sondern auch die Zellproliferation beeinflusst und möglicherweise als Biomarker für Krebsinvasion und -prognose fungiert. CSTF64 ist ein wesentlicher Polyadenylierungsfaktor und ein Hauptregulator der 3′-UTR-Verkürzung bei verschiedenen Tumorarten. Die Expression von CSTF64 wurde mit einer schlechten Lungenkrebsprognose in Verbindung gebracht, und eine Überexpression von CSTF64 förderte die Proliferation und Invasion von Lungenkrebszellen.

CFI und CFII (Spaltfaktoren I und II) bestehen aus CFIm25 (auch bekannt als NUDT21/Nudix-Hydrolase 21/CPSF5), CFIm59 und CFIm68, die alle stromaufwärts des konservierten UGUA-Motivs binden, um die Spaltreaktion zu vermitteln. Die CFIm-Bindung kann als primäre Determinante von pA-Stellen fungieren, indem sie eine gesamte pA-Region ausschleift und dadurch die Auswahl einer APA-Stelle auslöst. Andere Proteine, darunter Symplekin, Poly(A)-Polymerase (PAP) und Poly(A)-Bindungsprotein (PAB), können die Auswahl der APA-Stellen ebenfalls regulieren. PABs (PABII, RBBP6, PABPN1) binden an den wachsenden Poly(A)-Schwanz und verhindern die Interaktion zwischen CPSF und der Poly(A)-Polymerase. Diese Aktivitäten treten in erster Linie auf, wenn der Schwanz ~ 250 nts ist und der Zweck davon ist, die Poly(A)-Schwanzlänge zu kontrollieren, während APA in Progression ist.

Die Faktoren, die in die C/P-Maschinerie involviert sind, nehmen normalerweise an der APA-Regulation teil. Unter ihnen wurde CFIm25 als der wichtigste globale Regulator der APA identifiziert, dessen Knockdown nicht nur einen globalen Wechsel zur Verwendung des proximalen Poly(A)-Signals induziert, sondern auch die Stabilität und Expression des Zielgens verbessert. Huang et al. berichteten, dass die Depletion von CFIm25 die Transkriptionswerte von CCND1 und GSK3β signifikant erhöht und die Nutzung von dPAS durch mehrere Onkogene (IGF1R, CCND1 und GSK3β) verringert. Darüber hinaus zeigten Gen-Ontologie-Analysen (GO), dass CFIm25 nicht nur APA über MAPK-Signalwege moduliert, sondern auch mit krebsassoziierten Signalwegen und Protein-Ubiquitinierungs-Signalwegen verbunden ist. Darüber hinaus führt die Deletion von CFIm25 und CFIm68, nicht aber von CFIm59, zu einer Selektion proximaler Polyadenylierungsstellen in HEK293-Zellen. Xia et al. berichteten jedoch, dass es keine Unterschiede in der CFIm25-Expression zwischen Tumorgewebe und gesundem Gewebe gibt. Kubo et al. berichteten ebenfalls, dass CFIm möglicherweise keine Rolle bei der Auswahl der Poly(A)-Stellen spielt. Darüber hinaus wiesen Takagaki et al. nach, dass CSTF64 der erste Faktor bei der 3′-Endverarbeitung von APA ist und dass IgM APA zur Aktivierung von B-Zellen der Maus einsetzen kann. Obwohl CFIm eine Schlüsselrolle bei der Regulierung der APA zu spielen scheint, ist seine genaue Rolle noch unklar.

RNA-bindende Proteine (RBPs) können auch die Fähigkeit der APA beeinflussen, mRNAs anzusprechen, indem sie mit Proteinen der Polyadenylierungsmaschinerie konkurrieren oder deren Bindung an ihre Zielstellen verstärken. Xiang et al. analysierten die globalen APA-Profile aus einer großen Datenbank über verschiedene Krebsarten hinweg und schlugen vor, dass PABPN1 der Hauptregulator des APA-Profils über verschiedene Krebsarten hinweg ist. Ein CTRP-Datensatz zeigte, dass die PABPN1-Expression statistisch mit der Empfindlichkeit gegenüber 31 Medikamenten korreliert. RBPs können allein die Bindung anderer APA-Faktoren an die proximalen Poly(A)-Stellen verhindern oder die APA-Auswahl durch ihre Rolle bei der Aufrechterhaltung der RNA-Stabilität beeinflussen. Darüber hinaus können RBPs das dynamische APA-Profil regulieren und den Übergang von der Mitose zur Meiose fördern.

Wie wird APA reguliert

APA ist ein sehr umfassender molekularbiologischer Prozess, an dem zahlreiche zelluläre Elemente beteiligt sind. Derzeit wissen wir noch nicht viel über diesen einzigartigen biologischen Prozess. Die Situation hat sich jedoch in kurzer Zeit rapide verbessert, nachdem die wissenschaftliche Gemeinschaft die Bedeutung der APA in der Zellbiologie und ihre potenzielle Rolle als neues Ziel für die Krebstherapie erkannt hat. Die APA ist ein dynamischer und räumlich-zeitlich koordinierter Prozess mit zahlreichen Kernfaktoren. CFIm kann beispielsweise an die spezifische RNA-Sequenz in einer prä-mRNA binden und rekrutiert dann den Kernfaktor CPSF durch seine Interaktion mit einer CPSF-Untereinheit, hFip15 . CSTF-64 kann mit CPSF73 interagieren, aber nicht mit CFIm25. Es wurde beobachtet, dass sowohl die CSTF64- als auch die CPSF73-Konzentration in den Zellen, die in das gesunde Gewebe einwandern, erhöht ist, nicht aber die CFIm25-Konzentration. CFIm ist am frühen Schritt des Aufbaus des prä-mRNA-3′-Verarbeitungskomplexes beteiligt, indem es die Spaltung und die Poly(A)-Addition in Abhängigkeit von den Spiegeln seiner eigenen oder anderer Kernfaktoren und der RNA-Sequenz, die die potenziellen Spaltstellen umgibt, abwechselnd stimuliert oder unterdrückt.

Neben den Kernfaktoren sind auch verschiedene physiologische Bedingungen an der APA-Regulierung beteiligt, wie die lokale Chromatinstruktur, die Positionierung der Nukleosomen, die DNA-Methylierung und Histonmodifikationen. Interessanterweise können einige Faktoren, die an der 5′-terminalen Verkappung beteiligt sind, auch die Effizienz der Spaltung und Polyadenylierung beeinflussen.

Außerdem kann APA auf der Transkriptionsebene reguliert werden. Die Transkriptionsmaschinerie, wie z.B. die Transkriptionsinitiierung, -progression und das Spleißen, beeinflusst wahrscheinlich die Effizienz und Spezifität der Polyadenylierung. Daher wird die Untersuchung des Zusammenhangs zwischen den spezifischen Sequenzelementen in der Promotorregion und der Poly(A)-Stellenauswahl uns bei der Aufdeckung des Mechanismus hinter diesem interessanten Phänomen sehr helfen, was möglicherweise zur Entwicklung einer neuartigen Krebstherapiestrategie beitragen kann.

Wie APA methodisch analysiert wird

Seit 1980 die Auswirkungen von pAs in der IgM- und Dihydrofolatreduktase (DHFR)-Genkodierung beobachtet wurden, sind eine Reihe strenger Forschungsmethoden und -strategien entwickelt worden, um APA zu identifizieren und zu untersuchen, wie z. B. die Poly(A)-ClickSeq-Technologie der nächsten Generation (NGS) . Mit der Unterstützung dieser neuartigen Methoden, insbesondere mit dem Fortschritt der NGS-Technologie und der raschen Anhäufung von Sequenzierungsdaten dieser Genexpressionsvarianten, werden die experimentell ermittelten genetischen pA-Datenbanken kontinuierlich erweitert.

Basierend auf 3′-angereicherten RNA-seq-Protokollen können APA-Analysemethoden hauptsächlich in zwei Kategorien eingeteilt werden: Oligo(dT)-Priming-basierte Methoden und RNA-Manipulations-basierte Methoden . Da nur die auf die 3′-Termini der mRNA gemappten Reads für die APA-Entdeckung nützlich sind, sind diese Methoden durch die Anzahl der Reads begrenzt. Wenn die Leseabdeckung an den 5′- und 3′-Termini gering ist, eignet sich RNA-seq nicht zur genauen und umfassenden Identifizierung von APAs. Darüber hinaus besteht eine weitere Herausforderung darin, die Mehrdeutigkeit der Lesezuordnung aufgrund der Überlappung von Isoform-Transkripten zu beseitigen. Obwohl die Leselänge begrenzt ist, wurde eine Reihe von RNA-seq-Algorithmen entwickelt, um relative Änderungen der 3′-UTR-Länge zu quantifizieren und somit APA-Ereignisse vorherzusagen. In den letzten Jahren wurden auch mehrere pA-Erkennungs- und APA-Analysemethoden und -Algorithmen entwickelt, wie z. B. Dynamic Analyses of Alternative PolyA Adenylation (DaPars), 3USS, MISO, Roar, QAPA, und Change Points . In einem Bericht von Gruber und Zavolan aus dem Jahr 2019 werden diese Methoden miteinander verglichen.

DaPars ist die beliebteste Datenanalysemethode unter ihnen, obwohl QAPA effizienter und empfindlicher ist. DaPars identifiziert distale pAs auf der Grundlage von RNA-seq-Daten und verwendet dann ein Regressionsmodell zur De-novo-Identifizierung und Quantifizierung von dynamischen APA-Ereignissen zwischen zwei Bedingungen, unabhängig von einer vorherigen APA-Annotation. Die Wahrscheinlichkeit, sequenzierte Reads zu erhalten, ist für die einzelnen Isoformen einheitlich. Die pAs treten an Positionen entlang von Genorten auf, die einen deutlichen Abfall der RNA-seq-Leseabdeckung aufweisen. Nach der Korrektur der potenziellen RNA-seq Ungleichmäßigkeit Bias entlang der Genkörper, die genaue Lage der proximalen APA Website identifiziert werden kann, und die statistisch signifikante dynamische APAs und ihre Aktivitäten werden dann erkannt werden. Die wichtigste methodische Innovation von DaPars ist die direkte Ableitung von de novo APA-Ereignissen aus vorhandenen RNA-seq-Daten, ohne dass zusätzliche Experimente erforderlich sind. Ein weiterer Vorteil von DaPars ist, dass es die Überlappung benachbarter Gene, die zu falsch-positiven Ergebnissen führen kann, durch Erhöhung der Cutoffs auflösen kann. Aufgrund der ungleichmäßigen Leseabdeckung entlang der Loci schränkt diese Methode jedoch die Genauigkeit der De-novo-Erkennung von Poly(A)-Stellen ein, indem sie die Falsch-Positiv-Rate erhöht.

QAPA leitet APA quantitativ aus herkömmlichen RNA-seq-Daten ab, indem es die absolute Expression der alternativen 3′-UTR-Isoform direkt schätzt. Anschließend wird die relative Expression jeder Isoform unter allen Isoformen berechnet, um APA zu bewerten. Die Einschränkung von QAPA besteht darin, dass es vordefinierte pAs erfordert. Dieses Problem kann jedoch durch die Erstellung einer erweiterten Ressource von annotierten pAs, die Daten aus 3′-UTR-RNA-seq und anderen Ressourcen enthalten, entschärft werden. Aufgrund der Verzerrungen bei der Leseabdeckung am 3′-Terminus von Transkripten, der geringen Ausbeute an nicht-templierten Poly(A)-Schwanz-enthaltenden Reads und der Mehrdeutigkeit des Read-Mappings bei überlappenden Transkript-Isoformen sind die auf kanonischen RNA-seq-Daten basierenden Methoden bei dem Versuch, die pAs genau zu kartieren, begrenzt. Mit den Fortschritten der Molekulartechnik haben sich die Methoden zur Untersuchung von APA jedoch kontinuierlich weiterentwickelt. Wang et al. nutzten die CRISPR/Cas9-Methode, um die biologische Funktion von APA zu untersuchen, indem sie das schwache Poly(A)-Signal in ein kanonisches Poly(A)-Signal umwandelten und die Signale auf spezifische Poly(A)-Stellen richteten.

Kurz gesagt, jede der derzeit verfügbaren APA-Analysemethoden hat ihre Vorteile und Grenzen. Die analytischen Strategien, die auf kanonischen RNA-seq-Daten beruhen, werden in der APA-Forschungsgemeinschaft am häufigsten verwendet.

Einzellige Studie Der Vorteil des einzelligen Ansatzes besteht darin, dass er das Hintergrundrauschen von Bulk-Zellen, die eine Mischung von RNA-Material enthalten, das aus Zellen aus verschiedenen Geweben oder Differenzierungen gewonnen wurde, erheblich reduzieren kann.

Mit der Entwicklung der einzelligen Analysetechnologie wurden kürzlich APA-Variationen zwischen den Zellen untersucht. Obwohl die Einzelzell-APA-Forschung nur selten in großem Maßstab durchgeführt wurde, arbeitet diese Technik mit Einzelzell-RNA-seq (scRNA-seq) in großer Tiefe und voller Länge, was sie zu einem möglichen Werkzeug für die genaue Analyse der APA macht. Jingle Bells und scRNA-SeqDB (https://bioinfo.uth.edu/scrnaseqdb/) nutzten scRNA-seq-Datensätze, um eine Vielzahl von Krebsarten zu untersuchen. Ye et al. berichteten über die Verwendung von scRNA-seq-Daten zur Untersuchung der dynamischen APA-Nutzungsvariationen in verschiedenen mononukleären Zellarten des Knochenmarks aus einer großen Probensammlung, die sowohl gesunde Kontrollen als auch AML-Patienten enthielt. Sie fanden heraus, dass AML-Patienten im Vergleich zu gesunden Personen eine geringere APA-Diversität in acht verschiedenen Zelltypen aufzuweisen scheinen. Darüber hinaus wiesen sie nach, dass die APA-Regulierung bei der Erythropoese während der Leukämieprogression auf der Ebene der einzelnen Zelle eine wichtige Rolle spielt. Durch die Analyse von 515 scRNA-seq-Datensätzen von 11 Brustkrebspatientinnen berichteten Kim et al., dass zelltypspezifische APA auf Einzelzellebene anhand von 3′-UTR-Längenvariationen in Kombination mit Genexpressionsniveau und APA-Mustern identifiziert werden können. Darüber hinaus zeigten sie, dass immunspezifische APA-Signaturen bei Brustkrebs möglicherweise als prognostischer Marker für Brustkrebs im Frühstadium verwendet werden können.

APA und alternatives Spleißen: Obwohl es signifikante Unterschiede zwischen APA und alternativem Spleißen (AS) gibt, können sowohl APA als auch AS verschiedene Isoformen erzeugen und sogar während des prä-mRNA-Prozesses miteinander interagieren. Während APA vier typische Isoformen aufweist, gibt es bei AS sechs (Abb. 2). Mehrere eingehende Analysen von transkriptomischen Daten aus verschiedenen menschlichen Geweben und Zelllinien haben eine starke Korrelation zwischen APA und AS ergeben. Befindet sich das pA innerhalb des terminalen Exons, kann sich die APA wie eine spezielle Art von AS verhalten, die als CR-APA bezeichnet wird und kein In-Frame-Stoppcodon oder 3′-UTR besitzt und wahrscheinlich schnell durch den Non-Stop-Code-vermittelten mRNA-Zerfallsprozess abgebaut wird (Abb. 1b). Shen et al. berichteten, dass APA und der Spleißfaktor SRSF3 bei der Modulation des Zellalterungsprozesses zusammenwirken. Während APA bei einigen durch Spleißfaktoren vermittelten AS eine Rolle spielen kann, können Spleißfaktoren auch mit APA-Elementen zusammenarbeiten, um diesen Prozess zu unterstützen. So können beispielsweise U2AF2 und RBPs interagieren und CFI rekrutieren, um die Bildung des 3′-Terminus in der Nähe der Polypyrimidintrakte zu erleichtern. Darüber hinaus kann der CPSF-Komplex mit dem Spleißfaktor TFIID (Transkriptionsfaktor II D) bei der Regulierung der RNA-Polymerase II interagieren. Es wurde auch beobachtet, dass U1 snRNP (small nuclear ribonucleoprotein) innerhalb von Introns wirken kann, indem es die vorzeitige Spaltung und Polyadenylierung unterdrückt. Die Abreicherung von U1 führt auch zur Aktivierung von Intron-Poly(A)-Signalen und verursacht genomweite APA.

AS und APA konkurrieren auch bei CR-APA miteinander. Zum Beispiel kann die Ablation des Spleißfaktors 3B subunit1 (eine Komponente von U2 snRNP, auch SF3b1 genannt) das Intron PAS aktivieren. U1 snRNP kann auch unabhängig von APA Spleißaktivitäten beeinflussen. Da U1 snRNP an die 5′-terminale Region des Transkripts binden und die Erkennung potenzieller Spaltfaktoren blockieren kann, erhöht der Knockdown von U1 snRNP die Nutzung der pA-Stellen innerhalb von Introns in der Nähe dieses Transkriptbereichs. Movassat et al. wiesen jedoch nach, dass der Zusammenhang zwischen APA und AS auf terminale Introns beschränkt ist. Sie zeigten auch, dass der Knockdown von CstF64 indirekt die AS von hnRNP A2/B1, nicht aber von APA, in HeLa-Zellen beeinflussen kann.

Wie APA den Zellzyklus regulieren

Es gibt viele Gene, darunter TP53, CDC6 (Zellteilungszyklus 6), CyclinD1 (CCND1) und CDK (Cyclin-abhängige Kinase), die mit Zellzyklus-Kontrollpunkten verbunden sind und die Zellzyklus-Progression regulieren. Da prä-mRNA in der Regel mehr als eine pA-Stelle hat, werden die zellzyklusrelevanten Genprodukte durch den APA-Mechanismus moduliert und bilden verschiedene Isomere. Die 3′-UTR-Verkürzung von CDC6, einem wichtigen Regulator der DNA-Replikation, ist mit höheren CDC6-Proteinspiegeln und einem verstärkten Eintritt in die S-Phase in Brustkrebszellen verbunden. Cyclin D1, das in vielen Zelltypen eine entscheidende Rolle bei der Förderung des Übergangs von der G1- zur S-Phase spielt, unterliegt der APA-Regulierung sowohl über UTR-APA- als auch über CR-APA-Mechanismen. Darüber hinaus untersuchten Xiang et al. die obersten 10 % aller 20 532 Gene, die mit APA-Ereignissen assoziiert sind, und stellten fest, dass die meisten dieser Gene an Aktivitäten beteiligt sind, die mit der Chromatinstruktur zusammenhängen, was auf einen Zusammenhang zwischen der APA-Verarbeitung und der Veränderung der Chromatinstruktur schließen lässt. Mitra et al. fanden bei der Analyse von Hautwunden bei Mäusen heraus, dass APA als Bindeglied zwischen Zellzyklus und Gewebemigration fungiert. Sie wiesen nach, dass proliferierende Zellen in der Nähe von Wunden höhere Mengen an APA-Faktoren exprimieren als ruhende Fibroblasten in unverletzter Haut. PIGN, das den Zellzyklus durch Interaktion mit den Checkpoint-Proteinen für die Spindelmontage reguliert, weist in seinem 3′-UTR (Abb. 3) 6 pA-Stellen auf.

Wie APA mit miRNA bei der posttranskriptionellen Modulation interagiert

Mehr als 50% der konservierten microRNAs (miRNAs) zielen auf Stellen, die stromabwärts von proximalen pAs in Säugetiergenen liegen. Infolgedessen spielt die UTR-APA eine Schlüsselrolle bei der Regulierung der Interaktion zwischen Transkripten und miRNAs. APA wurde kürzlich als ein weit verbreiteter Mechanismus zur Kontrolle der Genstabilität und -expression identifiziert. Die miRNA-Zielorte befinden sich meist im 3′-UTR. Transkripte mit kürzerer 3′-UTR-Länge sind in der Regel stabiler, da ihnen die miRNA-Zielorte fehlen. Es wurde bereits gezeigt, dass APA ein entscheidender Regulationsmechanismus bei verschiedenen Krebsarten ist, wie z. B. Glioblastom, Leberzellkarzinom, Prostatakrebs und Brustkrebs. Gruber et al. berichteten jedoch, dass die 3′-UTR-Verkürzung nur einen begrenzten Einfluss auf die Proliferation von Mäusen und menschlichen T-Lymphozyten hat. Außerdem zeigte sich, dass nicht jedes APA-Ereignis mit höheren Proteinspiegeln verbunden ist. Mehrere Studien haben berichtet, dass die Auswirkungen der APA auf die mRNA-Stabilität und die Ribosomenbeladung marginal sind und von der zelltypspezifischen miRNA-Expression und der Verfügbarkeit von RNA-bindenden Proteinen abhängen. Ein typisches Beispiel ist die Regulierung der PAX3-Genexpression. PAX3 ist ein wichtiger Regulator der myogenen Differenzierung, dessen Transkript eine miR-206-Zielstelle in der 3′-UTR aufweist. PAX3-Isoformen zeigen jedoch unterschiedliche Differenzierungsmuster in verschiedenen Muskeltypen.

APA kann auch miRNA-Ziele modulieren, die sich in Introns befinden. Das ZFR-Gen wird durch seine intronische miRNA (miR-579) in der U87-Zelllinie beeinflusst. Hinske et al. berichteten auch, dass das APA-Signal eine Rolle bei der Übermittlung der negativen miRNA-Rückkopplung an das ZFP-Gen spielt.

APA beeinflusst die Genexpression nicht nur durch Verkürzung der 3′-UTR, um die miRNA-Zielstellen zu entfernen, sondern auch über andere molekulare Mechanismen. Masamha et al. berichteten, dass CFIm25 und miR-23 unabhängig voneinander die Expression der 3′-UTRs einer der Glutaminase-Isoformen unterdrücken. Obwohl mRNA der miRNA-Suppression durch Verkürzung der 3′-UTR entgeht, um die miRNA-Zielstelle zu entfernen (ein kanonischer APA-Mechanismus), gibt es also auch andere APA- und miRNA-Interaktionsmechanismen.

Aussichten

APA ist ein relativ neues biomedizinisches Forschungsgebiet. Obwohl wir in den letzten Jahren einige Meilensteine in der APA-Forschung erreicht haben, gibt es noch viel zu erforschen (Abb. 4). Die APA-Studien haben sich in den letzten Jahren auf die direkte Wirkung verschiedener transaktiver Faktoren konzentriert. Künftige Untersuchungen werden sich hoffentlich auf die Signalregulierung dieser trans-agierenden Faktoren auf molekularer und zellulärer Ebene konzentrieren. Es ist bekannt, dass APA eine entscheidende Rolle bei der Bearbeitung von prä-mRNAs spielt und die Spezifität und Stabilität der nachfolgenden mRNA-Isoformen bestimmt. APA ist an der Modulation der angeborenen antiviralen Immunantwort, der Regulierung der Krebsentstehung und -prognose sowie der Entwicklung von Arzneimittelresistenzen beteiligt. Dabei verhält sich APA je nach Gen, Zelltyp, Gewebetyp und sogar Krankheit unterschiedlich. Das Verständnis der APA und ihrer umfassenden Regulationsmechanismen bei menschlichen Krankheiten wird einen neuen Weg für die Präzisionsmedizin und die personalisierte Medizin eröffnen.