Gentherapie für nicht erbliche Erkrankungen

Es gab viele Fortschritte bei der Identifizierung der Mechanismen, die an chronischen Organschäden beteiligt sind, was Wege für Gentherapiestudien eröffnete. Während sich in den letzten Jahrzehnten eine Fülle von präklinischen und klinischen Studien auf die Entwicklung von Gentherapien für Erbkrankheiten konzentriert hat, gab es trotz mehrerer präklinischer Studien an Tiermodellen nur wenige klinische Versuche, die zur Untersuchung der therapeutischen Wirksamkeit von Gentherapien für nicht erbliche Krankheiten durchgeführt wurden. Eine kürzlich durchgeführte Studie zeigt, dass die Expression von Telomerase mit Hilfe von AAV9-Vektoren in einem Mausmodell für Lungenfibrose eine therapeutische Wirkung hat. Diese Therapie zielte auf idiopathische Lungenfibrose ab. Es ist bekannt, dass Telomere als Schutzstrukturen an den Enden der Chromosomen fungieren, und das Vorhandensein kurzer Telomere ist nachweislich eine der Ursachen für die Entstehung von Krankheiten. Bei dieser Erkrankung werden die Telomere zu kurz, was zu einer Unterbrechung der Zellteilung und damit zur Apoptose der Zellen führt. Telomerase ist ein Enzym, das die Länge der Telomere umstrukturieren kann. Povedano und Kollegen entwickelten eine Behandlung mit dem AAV-Serotyp 9, um Telomerase zur Korrektur der kurzen Telomere zu verabreichen. Da AAV9 bevorzugt auf regenerative alveoläre Typ-II-Zellen (ATII) abzielt, zeigen AAV9-Tert-behandelte Mäuse 1-3 Wochen nach der Vektorbehandlung eine verbesserte Lungenfunktion mit reduzierter Entzündung und Fibrose. Interessant ist, dass sich die Lungenfibrose 8 Wochen nach der Gentherapie entweder verbesserte oder verschwand. Die Behandlung mit AAV9-Tert führte zu längeren Telomeren und einer erhöhten Proliferation von ATII-Zellen sowie zu geringeren DNA-Schäden, Apoptose und Seneszenz.

Die aus AAV-Vektoren abgeleitete kardiale Gentherapie entwickelt sich zu einer völlig neuen Plattform zur Behandlung von Herzerkrankungen. AAV-Gentherapien zur Behandlung von Herzinsuffizienz wurden in präklinischen Studien an Tiermodellen validiert, und die überwiegende Mehrheit dieser Ansätze wurde zur Verbesserung der Kalziumverarbeitung durch Kardiomyozyten durchgeführt. Das in den meisten dieser Studien verwendete therapeutische Protein war die sarkoplasmatische Kalzium-ATPase (SERCA2a). Aufgrund der positiven präklinischen Ergebnisse wurde die erste klinische Studie (CUPID trial: calcium upregulation by percutaneous administration of gene vector in cardiac disease, NCT02346422) durchgeführt, um SERCA2a mit Hilfe eines AAV-Vektors vom Serotyp 1 zur Behandlung von Patienten mit fortgeschrittener Herzinsuffizienz zu verabreichen. Das Ergebnis dieser Phase-1-Studie war erfolgreich und ohne unerwünschte Ereignisse und wurde in eine Phase-2a-Studie überführt, die vielversprechende Ergebnisse mit einer signifikant niedrigen Rate an unerwünschten Ereignissen lieferte. Die Ergebnisse der klinischen Phase-2b-Studie (CUPID2b-Studie, NCT01643330), in der derselbe Vektor verwendet wurde, waren jedoch enttäuschend, da es keine signifikanten Veränderungen zwischen der Behandlungsgruppe und der Placebogruppe gab. Dies hat dazu geführt, dass die Rekrutierung von Patienten für zwei weitere Studien mit AAV1.SERCA2a eingestellt wurde. Interessanterweise gibt es zwei neue bevorstehende Studien, die darauf abzielen, S100A1 mit einem AAV9-Vektor und eine konstitutiv aktive Form der Proteinphosphatase-1-Inhibitoren, I1c, mit einem chimären Kapsid mit den Serotypen AAV2 und AAV8 zu verabreichen. Darüber hinaus haben sich AAV1, AAV6 und AAV9 als die vielversprechendsten AAV-Serotypen für den kardialen Gentransfer erwiesen, was auf erfolgreiche Gentherapieansätze zur Behandlung von Herzinsuffizienz in der Zukunft hoffen lässt.

AAV-vermittelte Gentherapieansätze zur Behandlung neuropathischer Schmerzen bei Nagetieren wurden ebenfalls berichtet. Fischer und Kollegen haben gezeigt, dass die Verabreichung von rAAV, das das Ca2+-Kanal-bindende Domäne 3 (CBD3)-Gen exprimiert, das Schmerzverhalten wie Hyperalgesie nach Berührung mit einer Nadel oder die Empfindlichkeit gegenüber Acetonstimulation in Tiermodellen für entzündliche und neuropathische Schmerzen deutlich reduziert. Eine andere Studie, bei der ein AAV9-Vektor verwendet wurde, der für eine kurze Haarnadel-RNA (shRNA) gegen den Vanilloidrezeptor 1 (TRPV1) kodiert, der ein wichtiges Zielgen für akute Schmerzen ist, zeigte, dass die Therapie die durch eine Nervenverletzung hervorgerufene thermische Allodynie (verstärkte Reaktion der Neuronen) 10 bis 28 Tage nach der Behandlung in einem Mausmodell mit geschonter Nervenverletzung (SNI) abschwächte. Diese Ergebnisse ermutigen Gentherapieforscher zur Entwicklung von Behandlungen auf der Grundlage von AAV-Vektoren für Patienten mit chronischen/diabetischen neuropathischen Schmerzen.

Beträchtliche Fortschritte wurden bei Gentherapieansätzen zur Behandlung chronischer Leberfibrose erzielt. Obwohl Angiotensin-Converting-Enzym (ACE)-Hemmer oder Angiotensin-Rezeptor-Blocker (ARB) bei Patienten mit Bluthochdruck weit verbreitet sind, wurden sie auch bei Patienten mit chronischer Lebererkrankung erprobt; die Ergebnisse waren jedoch nicht überzeugend, vor allem weil sie unerwünschte systemische Nebenwirkungen haben. Da es keine medizinischen Behandlungsmöglichkeiten gibt, ist die Lebertransplantation zwangsläufig zur einzigen Option für Patienten mit Lebererkrankungen im Endstadium geworden, die auf eine chronische Leberfibrose und/oder Leberzirrhose zurückzuführen sind. Angesichts der zunehmenden Häufigkeit chronischer Lebererkrankungen, des Mangels an Spenderorganen, der Komplikationen nach der Transplantation und der hohen Kosten der Lebertransplantation besteht ein großer Bedarf an der Entdeckung und Formulierung spezifischer, wirksamer, sicherer und kostengünstiger neuer Therapien für Leberfibrose/-zirrhose.

Ein möglicher Ansatz zur Umgehung dieses Problems ist die Entwicklung organbezogener antifibrotischer Strategien. Studien unseres Labors legen nahe, dass ein mögliches Ziel die „alternative Achse“ des Renin-Angiotensin-Systems (RAS) ist, die das Schlüsselenzym Angiotensin-Converting Enzyme 2 (ACE2) umfasst, das das starke profibrotische Oktapeptid Angiotensin II (Ang II) in ein antifibrotisches Heptapeptid, Angiotensin-(1-7) (Ang-(1-7)), umwandelt. Tierexperimentelle Studien haben gezeigt, dass rekombinantes humanes ACE2 (rhACE2) zur Vorbeugung von Bluthochdruck bei Herz-Kreislauf-Erkrankungen und zur Verbesserung der Nierenfunktion bei diabetischer Nephropathie nützlich ist. Interessanterweise wurde rhACE2 von einer Gruppe gesunder menschlicher Freiwilliger in einer klinischen Phase-1-Studie gut vertragen, ohne unerwünschte kardiovaskuläre Nebenwirkungen hervorzurufen. In einer Studie wurde über therapeutische Wirkungen von rekombinantem ACE2 bei experimenteller Leberfibrose berichtet, wobei die Leberschädigung chirurgisch durch Cholestase oder durch hepatotoxische Tetrachlorkohlenstoffinjektion ausgelöst wurde. Sie wiesen nach, dass rekombinantes ACE2 die Leberfibrose in beiden Tiermodellen der Lebererkrankung deutlich reduziert. Ein großer Nachteil dieses systemischen Ansatzes besteht jedoch darin, dass die Behandlung unweigerlich Off-Target-Effekte erzeugt, die in vielen Fällen unerwünscht sind. Die systemische Verabreichung von rekombinantem ACE2 birgt also mehrere Nachteile in sich. Dazu gehören tägliche Injektionen von ACE2, ein Verfahren, das im klinischen Umfeld invasiv und teuer ist und unerwünschte Auswirkungen auf die Blutdruckregulierung hat. Um dieses Problem zu umgehen, wäre es ideal, die gewebespezifischen ACE2-Spiegel im Zielorgan zu erhöhen. Daher wird erwartet, dass eine organspezifisch erhöhte ACE2-Aktivität unter Verwendung eines leberspezifischen rekombinanten AAV-Vektors therapeutische Wirkungen erzeugt, die auf das Zielorgan beschränkt sind, während unerwünschte Off-Target-Effekte minimiert werden.

Zusätzlich zur Verwendung eines leberspezifischen Capsid-Serotyps kann die Spezifität weiter erhöht werden, indem der Vektor mit dem ACE2-Gen unter der transkriptionellen Kontrolle eines starken leberspezifischen Promotors, Apolipoprotein E/humanes α1-Antitrypsin, konstruiert wird. In den von unserem Labor veröffentlichten Studien wurde ein pseudotypisierter leberspezifischer AAV-Vektor (rAAV2/8) für die präklinische Bewertung verwendet, und es wurde festgestellt, dass die hepatische Überexpression des murinen ACE2-Gens, das den Mäusen verabreicht wurde, nach einer einzigen intraperitonealen Injektion bis zu 6 Monate anhielt. Anschließend behandelten wir Mäuse mit einer Reihe von Lebererkrankungsmodellen, darunter Gallenfibrose, die durch die Ligatur der Gallengänge (BDL) ausgelöst wurde, toxische Verletzungen, die durch Injektionen von Tetrachlorkohlenstoff (CCl4) ausgelöst wurden, und fettleberassoziierte Leberfibrose, die durch die Fütterung mit Methionin- und Cholinmangel (MCD) ausgelöst wurde, mit einer einzigen intraperitonealen Injektion von rAAV2/8-ACE2. Die Behandlung führte zu einem starken Anstieg der ACE2-Expression und -Proteinaktivität, der sich auf die Leber beschränkte, ohne andere wichtige Organe zu beeinträchtigen. Im Gegensatz zu Erbkrankheiten, wie z. B. Hämophilie B, bei der eine relativ geringe Expression des Transgens in der Leber ausreichen kann, um den FIX-Spiegel im Blut geringfügig zu erhöhen, kann die Expression des Transgens, die für eine therapeutische Intervention bei nicht erblichen Krankheiten erforderlich ist, wesentlich höher sein. Dies wiederum kann eine Herausforderung für Gentherapieforscher darstellen. Interessanterweise haben wir jedoch bei unserem auf die Leber ausgerichteten therapeutischen Ansatz mit rAAV2/8-ACE2 festgestellt, dass eine erhöhte hepatische ACE2-Expression den hepatischen Spiegel des profibrotischen Ang II um mehr als 50 % reduzierte, verglichen mit Patienten, die mit einem Kontrollvektor behandelt wurden, der humanes Serumalbumin (rAAV2/8-HSA) trug. Die Verringerung von Ang II, die mit einem Anstieg der hepatischen Spiegel des antifibrotischen Ang-(1-7)-Peptids einherging, führte zu einer deutlichen Verringerung der Expression entzündlicher Zytokine, was in allen drei Modellen zu einer tiefgreifenden Verringerung der Leberfibrose führte (Abbildung 2). Diese Studien mit Kurzzeit-Tiermodellen wurden weiter validiert, um den Nachweis zu erbringen, dass in Langzeit-Tiermodellen der Gallenfibrose und der Fettlebererkrankung, die Leberläsionen hervorrufen, die eher mit denen von Patienten mit solchen Erkrankungen vergleichbar sind, eine einzige intraperitoneale Injektion von rAAV2/8-ACE2 eine tiefgreifende Verringerung der Leberfibrose bewirkt (Abbildung 3). In deutlichem Gegensatz zu anderen Studien mit AAV-Vektoren stellten wir fest, dass rAAV2/8-ACE2 die Serum-Alanin-Transaminase (ALT)-Spiegel in erkrankten Tieren im Vergleich zu denen, die den Kontrollvektor (rAAV2/8-HSA) erhielten, senkte, was darauf hindeutet, dass der Vektor selbst in der Leber sicher ist. Darüber hinaus führte die Injektion von rAAV2/8-HSA (bis zu 10 Tage) oder rAAV2/8-ACE2 (bis zu 24 Wochen) in gesunde Mäuse zu keiner Veränderung des ALT-Plasmaspiegels, was bestätigt, dass der Vektor selbst wahrscheinlich keine Leberschäden verursacht. Die schematische Darstellung des molekularen Mechanismus im Zusammenhang mit der ACE2-Gentherapie unter Verwendung des rAAV2/8-Vektors bei Leberfibrose ist in Abbildung 4 dargestellt.

Die gezielte Genverabreichung mit dem rAAV2/8-Vektor hat sich in der erwachsenen Leber als therapeutisch vielversprechend erwiesen, aber ihre Auswirkungen wurden in der unreifen Leber noch nicht eingehend untersucht. Obwohl rAAV2/8 die Leber neonataler Mäuse mit hoher Effizienz transduziert, ist der Vektor in der Leber nicht beständig und nimmt mit dem Leberwachstum rasch ab. Daher kann der erfolgreiche Einsatz einer rAAV2/8-vermittelten Therapie zur Behandlung von Lebererkrankungen im frühen Kindesalter eine erneute Verabreichung erfordern. Im Einklang damit zeigte eine andere Studie, dass die Behandlung von neonatalen Mäusen mit Ornithin-Transcarbamylase (OTC)-Mangel mit AAV2/8-OTC-Therapie die Mäuse im Erwachsenenalter nicht vor Hyperammonämie schützt. Somit bleibt die Herstellung einer stabilen Transduktion in der sich entwickelnden Leber eine der größten Herausforderungen für die leberspezifische rAAV2/8-Gentherapie, und die erneute Verabreichung von Vektoren könnte notwendig sein, um die therapeutische Wirksamkeit im Erwachsenenalter nach einer frühen neonatalen Behandlung aufrechtzuerhalten.

Obwohl die für präklinische Studien verwendeten AAV-Vektoren in der menschlichen Leber wirksam sein können, ist es wichtig, einen für menschliche Hepatozyten spezifischen AAV-Vektor mit verbesserter Transduktionseffizienz auszuwählen. Kürzlich haben zwei Gruppen vorgeschlagen, humanisierte Mäuse wie das immunsupprimierte FRG (Fah-/-/Rag2-/-/Il2rg-/-)-Mausmodell zu verwenden, um den besten rAAV-Serotyp für die leberspezifische Gentherapie zu ermitteln. Die Studien an einem humanisierten Mausmodell, das mit über 25 % menschlichen Hepatozyten besiedelt ist, ermöglichten es den Forschern, leberspezifische AAV-Vektoren wie LK-03 zu identifizieren, die aus einer Capsid-DNA-Shuffled-AAV-Bibliothek stammen. Diese Bibliothek wurde unter Verwendung von 10 AAV-Kapsidgenen erstellt. LK-03, der aus fünf verschiedenen elterlichen AAV-Kapsiden besteht, konnte im Vergleich zum AAV-Serotyp 8 menschliche primäre Hepatozyten in vitro und in einem Xenotransplantationsmodell für hepatozelluläres Karzinom in vivo mit höherer Effizienz transduzieren. Wang und Kollegen berichteten auch über eine höhere Lebertransduktion bei BRG-Mäusen unter Verwendung von AAVrh10-Kapsid, einem AAV der Klade E, das vom Rhesusaffen stammt, und AAV3B und haben gezeigt, dass AAV-LK-03-Vektoren entweder AAV3B oder AAV8 überlegen sein könnten. Es ist zu erwarten, dass Forscher zunehmend humanisierte Tiermodelle für andere Krankheiten als Lebererkrankungen verwenden werden, was es ihnen ermöglichen wird, neue Varianten der entwickelten AAV-Vektoren, die Transduktionseffizienz und die für das untersuchte menschliche Gewebe spezifischen Immunreaktionen zu ermitteln. Darüber hinaus wurde berichtet, dass der AAV3B-eGFP-Vektor, der in der Lage war, eine leberspezifische robuste GFP-Expression in den Lebern nicht-menschlicher Primaten zu bewirken, deutlich besser ist als AAV8 und keine offensichtliche Hepatotoxizität aufweist.