Proteine müssen mit anderen Proteinen wechselwirken, um funktionelle Komplexe zu bilden. In vielen Fällen kann die Proteinfunktion in der Zelle nicht verstanden werden, ohne Informationen über die Proteinstruktur und die Kenntnis darüber, in welchem Komplex sich das Protein befindet.1, 2 Dies ist zum Beispiel von größter Bedeutung für Proteine, die epigenetische Informationen auf der DNA modulieren. Fast alle diese Chromatin-modifizierenden Proteine erfordern eine intensive Interaktion mit Stoffwechselenzymen, die die für die Histonacetylierung, -deacetylierung oder -methylierung und -demethylierung erforderlichen Cofaktoren bereitstellen.3-5 Dies zeigt, wie wichtig es ist, die komplexe Umgebung eines bestimmten Proteins zu untersuchen, um dessen Funktion und Aktivitätszustand zu analysieren. Die Vernetzung von Proteinen in Kombination mit der Analyse durch Massenspektrometrie (XL-MS) ist eine ideale Methode, um Informationen über die Proteinstruktur und die Zusammensetzung von Proteinkomplexen zu gewinnen.6-9 Für XL-MS werden spezielle chemische Reagenzien, so genannte Crosslinker, benötigt, die in der Lage sind, Proteinreste kovalent zu verbinden, die sich in unmittelbarer Nähe befinden und beispielsweise in einem Komplex interagieren.10, 11 Die Charakterisierung der vernetzten Peptide mit Hilfe der Massenspektrometrie stellt jedoch aus zwei Gründen eine große Herausforderung dar. Erstens muss die Identifizierung von Querverbindungen durch die Analyse von Fragment-Ionen nicht nur eines, sondern zweier miteinander verbundener Peptide erfolgen, was die MS2-Spektren massiv verkompliziert. Zweitens haben die vernetzten Peptidarten nur eine sehr geringe Abundanz und sind Teil einer Peptidmischung, die überwiegend von nicht vernetzten Peptiden dominiert wird. In vielen Fällen führt dies zu einem dramatischen Informationsverlust, der die genaue Identifizierung von Vernetzungen und damit die Interaktomanalyse erschwert. Um diese Probleme zu lösen, wurden einige Vernetzungsreagenzien entwickelt, die MS-spaltbare Gruppen und die Möglichkeit der XL-Anreicherung einführten.12-18

Wir berichten hier über die Entwicklung eines neuen Vernetzungsreagenz, das anreichbar ist und Spaltungseigenschaften aufweist, die eine genaue Identifizierung von Vernetzungen ermöglichen. Der entworfene cliXlink (1) ist in Abbildung 1 dargestellt. Das zellpermeable Reagenz (Abbildung 1 A und Abbildung S1 in den begleitenden Informationen) verfügt über zwei Succinimidylester-Einheiten, die mit Nucleophilen in Proteinen reagieren können und einen Abstand von etwa 9 Å aufweisen; so können kurze Distanzen fixiert werden, um strukturelle Informationen über Proteine zu erhalten und Proteine in unmittelbarer Nähe zueinander zu erfassen. Eine effiziente MS-Spaltbarkeit wird durch die bewährte Sulfoxidgruppe gewährleistet, die vor der Peptidfragmentierung unter den Bedingungen der kollisionsinduzierten Dissoziation (CID) mit niedriger Energie gespalten werden kann. Darüber hinaus ermöglicht eine Alkin-Einheit, dass eine Anreicherungseinheit, z. B. Biotin, mit Hilfe der CuAAC-Reaktion an die vernetzten Stellen angehängt werden kann.19

Die Anwendung des Vernetzers kann dem in Abbildung 1 B dargestellten Arbeitsablauf folgen. Dabei wird Reagenz 1 zu einem komplexen Proteom hinzugefügt, wobei die Abstandsinformationen der Peptide im nativen Zustand in unmittelbarer Nähe fixiert werden und während des gesamten weiteren Arbeitsablaufs zur MS-Analyse erhalten bleiben. Das Anbringen der Affinitätsgruppe für die Anreicherung erfolgt nach der Vernetzung, um Störungen durch sperrige Anreicherungsgruppen zu vermeiden. Durch die Modifizierung der vernetzten Peptide auf Proteinebene können überschüssige niedermolekulare Reagenzien leicht durch Acetonausfällung entfernt werden. Anschließend erfolgt ein enzymatischer Verdau der Proteine. Die vernetzten Peptide werden auf diese Weise z. B. mit Biotin markiert, was ihre Anreicherung ermöglicht. Anschließend werden sie mit Hilfe der Massenspektrometrie analysiert. Da die einzelnen Peptidmassen in einem Crosslink nicht unmittelbar zugänglich sind, ist die Zuordnung von Crosslinks vor allem bei komplexen Proben schwierig. Dies erfordert die Verwendung von MS-spaltbaren Reagenzien, die die MS2-Identifizierung durch die Bildung spezifischer Fragment-Ionen erleichtern.20, 21 Im besten Fall sollte das Reagenz auch MS3-Experimente ermöglichen, was voraussetzt, dass der Vernetzer vor den Peptiden gespalten wird. Dadurch können die Peptide für eine individuelle MS3-basierte Identifizierung getrennt werden. Unser Reagenz 1 enthält β-Wasserstoffatome auf beiden Seiten des Sulfoxids, so dass die Fragmentierung in zwei Richtungen erfolgt, wie in Abbildung 1 C dargestellt. Dies führt zu einer sauberen Trennung der Peptide (α, β) und erzeugt zwei Fragmente für jedes Peptid: ein Alken- und ein Sulfensäurefragment; letzteres bildet bei Wasserverlust ein Thial. Dies ergibt zwei Massenpaare mit einem charakteristischen Δm/z≈32. Wichtig ist die Beobachtung, dass der Fragmentierungsweg a (Abbildung 1 C) vorherrscht. Daher sind für das α-Peptid das Alkenfragment und für das β-Peptid das Thialfragment die Hauptspaltprodukte. Aufgrund der asymmetrischen Spaltungseigenschaften bleibt der größte Teil der Signalintensität auf einem Fragment pro Peptid erhalten, was eine ausgezeichnete Empfindlichkeit bei MS3-Experimenten gewährleisten sollte.

Die Synthese von Reagenz 1 ist einfach (Schema 1). Ausgangspunkt ist das oxidierte Disulfiddimer von Homocystein 2, das mit 4-Pentynsäure behandelt wird, um Disulfid 3 zu erhalten. Durch reduktive Spaltung des Disulfids und Alkylierung der gebildeten Thiole mit 3-Brompropionsäuremethylester entsteht die Sulfidverbindung 4. Die Verseifung beider Methylester zu 5 und die Umwandlung von 5 in aktivierten Bissuccinimidylester 6, gefolgt von der Oxidation des Thioethers zum Sulfoxid, ergibt Reagenz 1 in einer Gesamtausbeute von 16 %. Besonders wichtig ist, dass das Reagenz sehr rein ist und die reaktiven Estereinheiten auf beiden Seiten vorhanden sind. Eine partielle Hydrolyse muss vermieden werden. Dies wurde durch eine abschließende Fällungsreinigung sichergestellt. Reagenz 1 wurde in einem Gemisch aus Ethylacetat und Dichlormethan gelöst und nach Zugabe von Hexan ausgefällt.

Als nächstes untersuchten wir die MS-Eigenschaften von 1. Zu diesem Zweck fügten wir 1 dem häufig verwendeten Modellprotein Rinderserumalbumin (BSA) hinzu. Wir folgten dem in Abbildung 1 B dargestellten Arbeitsablauf, ohne den Anreicherungsschritt durchzuführen. Kurz gesagt, nach der Zugabe von 1 zur Proteinlösung und einer Reaktionszeit von 1 h bei Raumtemperatur und physiologischem pH-Wert haben wir das Protein mit Aceton ausgefällt, es in Puffer resuspendiert (siehe unterstützende Informationen) und das Protein anschließend mit einer Mischung aus Trypsin und Lys-C verdaut.

Das erhaltene Peptidgemisch wurde mit C18-Tip-Säulen entsalzt und mittels HPLC-MS2 analysiert (Abbildung 2). Abbildung 2 A zeigt als Beispiel zwei vernetzte BSA-Peptide (α+β). Nach der Bestimmung der genauen Masse der intakten Vernetzung (m/z 677,1; Abbildung 2 B) führten wir sowohl CID- als auch HCD-Fragmentierung an der Vorstufe durch, um die Fragmentierungseigenschaften zu bewerten (Abbildung 2 C). Die selektivere CID-Fragmentierung (Resonanzanregung des Vernetzungsions; Abbildung 2 C, oberes Spektrum) bei einer niedrigen normalisierten Kollisionsenergie von 25 % liefert erwartungsgemäß nur eine kleine Anzahl intensiver Signale. Zwei auffällige Signalpaare mit Δm/z von 32 (Δmrep) sind auf die Fragmentierung des Vernetzers zurückzuführen, die zu einem Thial- (α-/β-Thial) und einem Alken- (α-/β-Alken) Fragment für jedes Peptid führt. Wie bereits erwähnt, wird der Fragmentierungsweg a (Abbildung 1 C) bevorzugt, was zu einer asymmetrischen Intensitätsverteilung führt. Die dominante Bildung der erwarteten intakten, abgetrennten Peptide macht das Reagenz folglich für anspruchsvollere MS3-Experimente zugänglich.

Für unsere Studie haben wir HCD-Fragmentierung verwendet. Diese Methode ermöglicht die gleichzeitige Spaltung des Crosslinkers und die Bildung der für die Identifizierung erforderlichen Peptidfragmente (Abbildung 2 C, unteres Spektrum). Um die Erkennung von Vernetzungen und Peptiden zu erleichtern, ist es wichtig, dass die HCD-Fragmentierung weiterhin die Alken- und Thialfragmente liefert. Die HCD-Daten ermöglichen daher die Identifizierung von Peptiden durch MS2.

Anhand dieser Methode analysierten wir die Daten mit der frei erhältlichen MeroX-Software, wobei wir alle Crosslink-Identifizierungen streng filterten (Score >50, Falschentdeckungsrate (FDR) 1 %) und das Vorhandensein von mindestens drei der vier Ionen der beiden charakteristischen Massenpaare verlangten.23, 24 Ohne die Möglichkeit der CuAAC-basierten Anreicherung zu nutzen, konnten wir 61 einzigartige BSA-Crosslinks in einer einzigen Messung identifizieren (Abbildung 2 D).25 Dieses Ergebnis ist repräsentativ für Messungen, die in unserem Labor mit gereinigtem BSA durchgeführt wurden. Darüber hinaus haben wir die in der BSA-Kristallstruktur gefundenen Quervernetzungen dargestellt und festgestellt, dass die Mehrzahl der gemessenen Abstände angemessen war. Wichtig ist, dass die Vernetzungen einen mittleren Cα-Cα-Abstand zwischen den vernetzten Aminosäuren von 22,1 Å und eine Abstandsverteilung zeigen, die perfekt mit dem übereinstimmt, was für die Vernetzung mit einem Reagenz erwartet wird, das die aktiven Ester um etwa 9 Å beabstandet (Abbildungen 2 E und S2)26 und die Seitenkettenlängen und die molekulare Dynamik des Proteins berücksichtigt.27 Die Vernetzung erfolgte hauptsächlich zwischen zwei Lys-Resten (49 %), aber wir konnten auch Lys-Thr- (30 %), Lys-Ser- (13 %) und Lys-Tyr- (8 %) Verbindungen nachweisen, was mit der Reaktivität der Succinimidylester übereinstimmt (Abbildung 2 F).28

Dieser Erfolg erlaubte uns, den neuen Vernetzer in einer komplexeren Umgebung zu validieren. Wir wollten insbesondere den zusätzlichen Wert der CuAAC-basierten Anreicherungsmöglichkeit zeigen. Für dieses Experiment vernetzten wir erneut das BSA-Protein (10 μg), fällten es mit Aceton, lösten das vernetzte Protein wieder auf und führten anschließend die Klick-Reaktion (Abbildung S3 A) durch, indem wir 7 (Abbildung 3 A) und CuSO4/Tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amin (THPTA) hinzufügten, gefolgt von der Reduktion von CuII zu CuI bei Zugabe von Natriumascorbat. Nach 1 Stunde bei Raumtemperatur führten wir eine weitere Acetonausfällung durch, um überschüssiges Biotinazid zu entfernen. Anschließend fügten wir Trypsin und Lys-C zum Verdau hinzu.

Diese Peptide wurden anschließend mit einem Proteinverdau aus einem HEK-Zellextrakt (435 μg Protein; Abbildung 3 B) kombiniert. Dadurch entsteht ein massiver Hintergrund von nicht vernetzten Peptiden. Wenn wir nun die Querverbindungen innerhalb dieses großen Hintergrunds analysierten (Abbildung 3 C), identifizierten wir nur eine sehr geringe Anzahl von Querverbindungsspektren (mittlere CSMs=5,0), einzigartige vernetzte Stellen (mittlere einzigartige XLs=3,7) sowie Monolinks (mittlere=5,3), bei denen ein Succinimidylester vor der Reaktion mit dem Protein hydrolysiert wurde. Wenn wir jedoch die Anreicherung mit Streptavidin-beschichteten magnetischen Beads durchführten, verbesserte sich die Anzahl der Crosslink-Identifizierungen dramatisch. Nach der Inkubation der Peptidmischung mit den magnetischen Partikeln, ausgiebigem Waschen (6-mal) der Beads mit Puffer (siehe unterstützende Informationen) und einer milden reduktiven Spaltung des Disulfids, um die „eingefangenen“ Querverbindungen freizusetzen und dadurch den Biotin-Anteil zu entfernen (Abbildung S3 B), konnten wir nun im Durchschnitt 95,0 CSMs und 37,0 einzigartige XLs zusammen mit 184,3 Monolinks nachweisen. Die Anzahl der identifizierten eindeutigen XLs war geringer als bei gereinigtem BSA (Abbildung 2 D), was durch Ineffizienzen in der CuAAC-Reaktion oder durch Interferenzen des nicht vernetzten Komplexhintergrunds erklärt werden könnte. Dieses Ergebnis zeigt jedoch, dass unser neuer Vernetzer 1 in der Lage ist, vernetzte Peptide in einem großen Überschuss an unmodifizierten Peptiden anzureichern und so die Analyse komplexer Proben mit wenig Vernetzungen zu erleichtern. Ursprünglich waren wir skeptisch gegenüber der asymmetrischen Struktur von 1. Die Daten zeigen jedoch, dass trotzdem eine große Anzahl von Querverbindungen identifiziert wird.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass unser neuer Crosslinker 1 die folgenden Vorteile vereint: Erstens ist die Größe des Reagenzes ideal geeignet, um wertvolle Abstandsinformationen für die strukturelle Proteomik zu gewinnen. Darüber hinaus ist das Molekül zelldurchlässig, und die Alkineinheit stört die Vernetzungsreaktion nicht wesentlich. Außerdem vereinfacht die robuste, effiziente Sulfoxidfragmentierung die Identifizierung von Vernetzungen. Die Möglichkeit, mit 1 vernetzte Peptide durch Click-Chemie zu funktionalisieren, erlaubt die Anwendung verschiedener Modifikationen und Anreicherungsstrategien, die die Analyse von wenig verbreiteten Vernetzungen ermöglichen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass unser Reagenz 1 nun den Weg für komplexe Interaktomanalysen mit Hilfe von MS2- und MS3-Experimenten ebnet.

Interessenkonflikt

Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht.